• Aceruloplasminemia
• Caeruloplasmin
• Ceruloplasmina
• new missense mutations
• nuove mutazioni missenso

Introduzione: l’Aceruloplasminemia (ACP) è una malattia rara autosomica recessiva causata da mutazioni a carico del gene CP, codificante per la proteina Ceruloplasmina (Cp). La Cp appartiene alla famiglia delle ossidasi multi-rame e tra le sue molteplici funzioni gioca un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo del ferro, catalizzando nel plasma l’ossidazione degli ioni ferrosi (Fe2+) a ioni ferrici (Fe3+) risultando pertanto la principale ferrossidasi plasmatica.
L’ACP è caratterizzata dall’accumulo di ferro in vari organi, compreso il cervello, determinando un quadro clinico caratterizzato da degenerazione retinica, anemia con iperferritinemia, diabete mellito e sintomi neurologici accompagnati da neurodegenerazione. Difetti quantitativi (deficienza dei livelli) o qualitativi della Cp (assenza dell’isoforma Holo-Cp, carica di rame e funzionalmente attiva) contraddistinguono l’ACP. La malattia fu descritta per la prima volta in Giappone nel 1987 e l’attuale prevalenza stimata di 1:2.000.000 si basa su uno studio del 1999 condotto su un campione limitato (N=4990) della popolazione adulta giapponese. Ad oggi sono stati pubblicati circa 110 casi di ACP. Come per la maggior parte delle malattie rare, il limitato numero di studi condotti, una carente consapevolezza dell’esistenza della patologia e la mancanza di un trattamento curativo contribuiscono ad un circolo vizioso che rende l’ACP sottodiagnosticata. In questo contesto, i database genomici pubblici, ad oggi contenenti genomi ed esomi di centinaia di migliaia di individui, costituiscono uno strumento prezioso per identificare nuove mutazioni in grado di provocare un fenotipo ACP se presenti in omozigosi o in eterozigosi composta. Queste informazioni, opportunamente valutate ed integrate, possono migliorare considerevolmente le stime di prevalenza delle malattie rare ed ultra-rare nella popolazione. A tale scopo ed anche a scopo diagnostico, la corretta classificazione delle varianti CP come patogenetiche o benigne è essenziale, ma a causa della carenza di analisi funzionali, un numero significativo di varianti viene riportato come varianti di significato incerto. Scopo: In questo progetto di tesi, lo scopo è stato di classificare correttamente alcune selezionate varianti missenso sul gene CP mediante produzione di mutanti di Cp e loro caratterizzazione funzionale in vitro. Le varianti missenso sono state considerate le più interessanti per la possibilità di poterle confrontare da un punto di vista funzionale con la proteina wild-type (WT), a differenza di altri tipi di mutazioni (quali ad es. delezioni, frameshift, etc.) che provocano la mancanza della proteina nella sua interezza.
Materiali e metodi: Attraverso il database di aggregazione del genoma (gnomAD) sono state identificate tutte le varianti missenso del gene CP fino ad oggi conosciute per essere presenti nella popolazione. A seguito di un’analisi della letteratura e di database scientifici, sono stati identificati sia i residui amminoacidici fondamentali per la corretta funzione della Cp, sia i cambi amminoacidici associati ad ACP. Dall’incrocio di questi dati e tenendo conto della frequenza allelica sono state selezionate 5 varianti missenso candidate per essere patogenetiche e 7 varianti missenso già associate ad ACP ed utilizzate come controlli per convalidare la robustezza dei test funzionali ed offrire per la prima volta un confronto diretto tra varianti ACP. Cellule umane HEK293T sono state trasfettate in transiente con plasmidi contenenti la sequenza cDNA di Cp ricombinante (rCp) umana WT o le sequenze mutate codificanti per le 12 varianti selezionate. Per valutare l’impatto delle mutazioni sulla secrezione della proteina e sulla sua attività sono stati eseguiti saggi di caratterizzazione biochimica e funzionale, confrontati con l’espressione in parallelo della proteina WT. Conclusione: Questi studi hanno permesso di identificare due nuove varianti del gene CP presenti nella popolazione umana che, se presenti in omozigosi o eterozigosi composta, danno luogo ad una carenza di attività della proteina paragonabile a quella associata a mutazioni ACP descritte in letteratura. I risultati rappresentano un importante contributo sia per quanto riguarda la diagnosi dell’ACP sia per una conoscenza più approfondita dello spettro di possibili mutazioni ad essa associato.