• microscopia ottica
• TEM
• SEM
• WST-1
• spettroscopia UV-Vis
• biocompatibilità
• test di citotossicità
• DSC
• FTIR
• ELS
• DLS
• CAWS
• nanoprecipitazione
• strutture 3D
• manifattura additiva
• idrogeli
• nanoparticelle
• PLGA
• biomateriali polimerici
• Chitosano
• Eugenolo

L’interesse nell’impiego di oli essenziali in ambito biomedico e farmaceutico è sempre più forte data la presenza in essi di molecole bioattive.Tra queste è presente l’eugenolo, un composto aromatico, che ha suscitato molto interesse a seguito delle sue molteplici proprietà, quali antimicrobiche,antitumorali,antiinfiammatorie e antiossidanti. Nonostante le molteplici attività esplicabili da questa molecola, l’eugenolo presenta caratteristiche che rendono difficile il suo utilizzo: sensibilità all’ossidazione e alla luce, instabilità chimica e bassa solubilità in mezzi acquosi. Per poter quindi superare questi limiti, è necessario incapsulare questo principio attivo, in modo tale da mantenere inalterate le proprietà della molecola o aumentarne la bioattività.Sono molteplici le formulazioni che si possono utilizzare per incapsulare molecole bioattive e tra queste ritroviamo quelle che si basano sull’utilizzo di polimeri, quali micro/nanoparticelle o idrogeli.Il fine di questo lavoro di tesi è stato la preparazione, caratterizzazione chimico-fisica e la valutazione biologica di due diversi sistemi polimerici per l’incapsulamento di eugenolo, quali nanoparticelle a base di poli(D,L acido lattico-co-glicolico) (PLGA) e strutture 3D a base di chitosano. Il PLGA è un copoliestere di sintesi approvato per uso medico dagli organismi Food and Drug Administration (FDA) ed European Medicines Agency (EMA). Il chitosano è un polisaccaride ottenuto a partire da scarti dell’industria alimentare con comprovata biocompatiblità.Mediante tecnica di nanoprecipitazione, sono state preparate tre tipologie di sospensione colloidale che differiscono per la concentrazione di PLGA utilizzata nella soluzione polimerica di partenza: 1, 5 o 10 mg/mL (denominate rispettivamente PLGA-1, PLGA-5 e PLGA-10). La loro caratterizzazione dimensionale è stata condotta mediante Dynamic Light Scattering (DLS), dimostrando che il diametro idrodinamico medio dei nanoformulati è influenzato dalla concentrazione di PLGA, con valori medi in un range compreso tra 145 e 200 nm. La presenza sulla superficie delle nanoparticelle di un rivestimento di chitosano, utilizzato come agente stabilizzante durante la nanoprecipitazione, ė stata confermata mediante spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FT-IR) e misura del valore del potenziale Zeta. Lo studio dell'efficienza di incapsulamento di eugenolo, valutata mediante estrazione con solvente e spettroscopia UV-vis, ha mostrato valori pari al 26% per quanto riguarda le nanoparticelle PLGA-10, e valori inferiori per le altre due tipologie di nanoparticelle.Le strutture 3D a base di chitosano sono state preparate mediante manifattura additiva (Stampa 3D), utilizzando la tecnica Computer-aided wet-spinning (CAWS). La presenza di eugenolo nelle strutture 3D è stata confermata a seguito di analisi effettuata con calorimetria a scansione differenziale (DSC). Analisi mediante spettroscopia UV-Vis del bagno di coagulazione impiegato nella stampa hanno mostrato un'efficienza di incapsulamento pari a circa 56%.Sono stati quindi effettuati esperimenti di citocompatibilità in vitro delle nanoparticelle PLGA-10 e delle strutture 3D, entrambe non caricate o caricate con eugenolo, impiegando la linea cellulare di fibroblasti embrionali murini Balb/3T3 Clone A31. Le prove di citocompatibilità sono state eseguite utilizzando un test colorimetrico basato sul sale di tetrazolio WST-1.Per quanto riguarda le nanoparticelle, i risultati ottenuti hanno dimostrato la citocompatibilità dei sistemi prodotti in accordo ai valori di riferimento definiti dalla norma ISO 10993, anche se concentrazioni di NPs caricate con eugenolo pari o maggiori di 28.13 μg/mL hanno indotto una riduzione significativa della vitalità cellulare rispetto al controllo. Relativamente alle strutture 3D, sono stati condotti due test di citotossicità, il test degli estratti e il test per contatto diretto, i quali hanno confermato la citocompatibilità di queste strutture, avvalorata ulteriormente da analisi qualitative effettuate tramite microscopia ottica. Tramite il test per contatto diretto, è stata evidenziata una riduzione significativa della vitalità cellulare sulle strutture 3D caricate, dopo 14 giorni dalla semina e una vitalità marcatamente superiore sul fondo dei pozzetti in cui sono state mantenute in coltura le strutture 3D. La scarsa densità cellulare sulle strutture 3D è stata confermata mediante analisi con microscopia a scansione elettronica (SEM). Questi risultati ci suggeriscono che queste strutture 3D possano essere ulteriormente studiate in futuro per lo sviluppo di membrane biocompatibili con proprietà antiadesive.Infine, sono stati svolti esperimenti preliminari con l’obiettivo di combinare i due sistemi polimerici, in modo da ottenere una struttura 3D a base di chitosano caricata con nanoparticelle di PLGA contenenti eugenolo.