• progressione tumorale
• effetto Warburg
• LDH-5
• fermentazione lattica
• ipossia

Le cellule sopravvivono grazie alla glicolisi in cui viene prodotta energia dalla degradazione del glucosio in due molecole di piruvato. In presenza di ossigeno, il piruvato viene attivato ed entra nel ciclo di Krebs. Successivamente, grazie alla fosforilazione ossidativa (OXPHOS), si produce ATP e si rigenerano i cofattori ossidati (NAD+) necessari per continuare la glicolisi.
Nella fosforilazione ossidativa l’ossigeno (O2) è un componente essenziale, in quanto è l’accettore ultimo degli elettroni che derivano dall'ossidazione dei cofattori sopracitati. Se le cellule si trovano in ipossia non possono attivare questo processo in quanto carenti di ossigeno e devono necessariamente trovare un'altra via per ottenere NAD+ e quindi consentire alla glicolisi di continuare: utilizzano perciò la fermentazione lattica. Ottenere energia tramite processi glicolitici risulta tuttavia meno efficiente rispetto alla fosforilazione ossidativa e, come conseguenza, le necessità di glucosio aumentano notevolmente. Questo fenomeno fu individuato la prima volta da Pasteur: egli, infatti, vide che le cellule, sottoposte a ridotto apporto di ossigeno, prediligono l'attività glicolitica a discapito della mitocondriale e parallelamente incrementano il consumo di glucosio, mentre quando ritornano in situazioni di normossia riprendono ad utilizzare i processi ossidativi.
A livello tumorale, situazioni di ipossia, acuta o cronica, possono innescare tali cambiamenti metabolici. Tuttavia, il comportamento cellulare in questo caso è anomalo: infatti, anche riportando le cellule a concentrazioni normali di ossigeno, i bisogni di glucosio rimangono elevati a dimostrare la preferenza per il processo glicolitico piuttosto che per la fosforilazione ossidativa: questo fenomeno viene chiamato effetto Warburg o glicolisi aerobica.1
L'ipossia che si riscontra a livello tumorale è causata dallo squilibrio tra bisogni della massa tumorale in crescita e la capacità del sistema vascolare di portare nutrienti ed ossigeno. Una caratteristica delle cellule cancerose è la loro rapida ed incontrollata proliferazione, che risulta essere la causa principale delle alterazioni strutturali e funzionali del microcircolo tumorale. Infatti, le masse in crescita possono comprimere e quindi ostruire i lumi vasali generando a valle delle zone ischemiche e provocando così situazioni di ipossia acuta. Inoltre la rapida crescita allontana le cellule dai vasi che forniscono nutrienti ed ossigeno, come conseguenza si verifica un aumento notevole delle distanze di diffusione che provoca situazioni di ipossia cronica.
Le cellule tumorali per ovviare al problema stimolano l'angiogenesi: la crescita vascolare avviene tuttavia ad una velocità inferiore rispetto alla proliferazione tumorale e i vasi neoformati hanno una disposizione irregolare e tortuosa. Questo può essere la causa di interruzioni del flusso di ossigeno e nutrienti e portare così a fenomeni di ipossia acuta.
Poichè studi hanno dimostrato che l'efficacia di radio e chemioterapie si basa sull' ossigenazione del tessuto, una situazione di ipossia provoca numerosi problemi al trattamento della neoplasia.
Il basso livello di ossigeno, non solo rende resistente il tumore alle comuni terapie, ma incrementa la invasività e l'aggressività delle cellule che lo costituiscono. Questo può fornire una spiegazione all'effetto Warburg: nell'evoluzione tumorale si assiste ad un meccanismo di selezione cellulare di tipo darwiniano e il cambiamento nel tipo di metabolismo conferisce alla cellula dei vantaggi per la crescita.
Cellule caratterizzate da un fenotipo glicolitico non sono suscettibili ad oscillazioni nella concentrazione di ossigeno, ricavano energia molto velocemente e generano grandi quantità di acido lattico che acidifica il microambiente e risulta tossico per le altre cellule. Inoltre, questa acidificazione aumenta l'invasività cellulare poiché favorisce la degradazione della matrice extracellulare ed ha quindi un ruolo nel passaggio a tumore metastatico.
La capacità delle cellule di adattarsi e sfruttare a proprio vantaggio l'ipossia è in gran parte resa possibile dall' intervento di un fattore di trascrizione attivato dalla carenza di ossigeno: HIF-1. Questo fattore, a livello molecolare, media infatti una serie di importanti eventi: si innesca la sovra-espressione di molti enzimi coinvolti nel metabolismo glicolitico, tra cui LDH-5, esochinasi (HK-1 e HK-2) e di diversi trasportatori del glucosio come GLUT-1 e GLUT-3. Allo stesso tempo, determina la sovra-espressione di fattori ematopoietici come l'eritropoietina e del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) responsabile dell'angiogenesi. HIF-1, aumentando la produzione di anidrasi carbonica (CA-9 e CA-12) e di trasportatori di membrana MCT-1 e MCT-2, è inoltre la causa dell'acidificazione dell'ambiente extracellulare.
La situazione sopra descritta può comunque essere sfruttata per ottenere della terapie selettive che vadano a colpire in modo specifico le zone ipossigenate caratterizzanti i tumori invasivi, che non si trovano nei distretti sani dell'organismo.
Questo intento può essere raggiunto tramite l'utilizzo di profarmaci ipossi-selettivi,2 costituiti da una porzione interruttore, sensibile a concentrazioni di ossigeno molto basse, inferiori a quelle riscontrate in fegato, midollo osseo, cartilagini, e da una porzione in grado di esercitare l'azione citotossica.
Un altro target innovativo nell'ambito delle terapie antitumorali ipossi-selettive è risultato essere l'enzima LDH-5 che catalizza la riduzione del piruvato a lattato con rigenerazione del NAD+.
Esercitando un'inibizione su questo enzima si privano le cellule tumorali della capacità di rigenerare cofattori ossidati, essenziali per non interrompere l'attività glicolitica e il rifornimento di energia.
A conferma del ruolo chiave dell'enzima sono stati eseguiti studi in vitro su linee cellulari tumorali, i quali dimostrano che, riducendo i livelli di LDH-5 con sh-RNAs, la proliferazione cellulare in condizioni di ipossia va incontro ad un calo netto, mentre inducendo di nuovo l'espressione di LDH con cDNA si ripristinano i livelli di proliferazione originari.3
Per quanto riguarda gli effetti collaterali dovuti all' inibizione enzimatica, si osserva che pazienti con deficit ereditario di LDH-5 non presentano problemi in condizioni di riposo, ma danni a livello muscolare e mioglobinuria solo dopo intenso sforzo fisico.3 Questi elementi sono perciò a favore di terapie basate sull’inibizione di questo target.





Figura 1: Effetti dell'inibizione dell' LDH su cellule sane e tumorali



Nel mio lavoro di tesi ho sintetizzato molecole inibitrici dell'enzima LDH-5, in particolare composti con struttura N-idrossiindol-2-carbossilica (NHI) aventi come sostituenti in posizione 6 dei gruppi arilici o dei gruppi solfonammidici, opportunamente sostituiti. La presenza del gruppo acido libero e dell'ossidrile in posizione vicinale risultano infatti essenziali per l'azione inibitoria sul target: questo elemento è emerso da studi svolti su composti appartenenti a diverse classi chimiche4 e successivamente confermato da esperimenti eseguiti in precedenza nel laboratorio dove ho svolto la tesi.
Lo schema di sintesi a cui mi sono attenuta è il seguente (Schema 1):


Schema 1.
Reagenti e condizioni: a) NaH, (COOCH3)2, DMF anidra, -15 °C→t. a.; b) SnCl2•2H2O, PhSH, Et3N/CH3CN ; c) LiOH 2 N, THF/CH3OH 1:1.

Il primo step di sintesi consiste nella formazione del chetoestere da derivati nitrotoluici di tipo 1, opportunamente sostituiti: il NaH, deprotonando il gruppo metilico, forma un carbanione che attacca il dimetil-ossalato fornendo l'intermedio desiderato 2. Il passo successivo consiste in una ciclizzazione riduttiva in cui il gruppo nitro viene ridotto ad idrossilammina, la quale attacca il carbonio carbonilico. Si assiste quindi ad una disidratazione che porta alla formazione dello scheletro N-idrossiindolico 3. Infine mediante l'idrolisi del gruppo estereo si ottiene l'acido libero 4.



RIFERIMENTI:

1. Gatenby, R. A.; Gillies, R. J. Why Do Cancers Have High Aerobic Glycolysis?, Nature Rev. Cancer 2004, 4, 891-899.
2. Chen, Y.; Hu, L. Design of Anticancer Prodrugs for ReductiveActivation. Med. Res. Rev. 2009, 29, 29-64
3. Fantin, V. R.; St-Pierre, J.; Leder, P. Attenuation of LDH-A Expression Uncovers a Link between Glycolysis, Mitochondrial Physiology, and Tumor Maintenance, Cancer Cell 2006, 9, 425-434.
4. Cameron, A.; Read, J.; Tranter, R.; Winter, V. J.; Sessions, R. B.; Brady, R. L.; Vivas, L.; Easton, A.; Kendrick, H.; Croft, S. L.; Barros, D.; Lavandera, J. L.; Martin, J. J.; Risco, F.; Garcìa-Ochoa, S.; Gamo, F. J.; Sanz, L.; Leon, L.; Ruiz, J. R.; Gabarrò, R.; Mallo, A.; Gòmez de las Heras, F. Identification and Activity of a Series of Azole-based Compounds with Lactate Dehydrogenase-directed Anti-malarial Activity, J. Biol. Chem. 2004, 279, 31429-31439.