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Il sistema fotoneuroendocrino traduce le condizioni di luce ambientali nella produzione di segnali endocrini e neuroendocrini. Centrale per questo processo è l’organo pineale che svolge un ruolo evolutivamente conservato nella sintesi ciclica e nel rilascio ritmico di melatonina, un ormone che è in grado di influenzare il ritmo del sonno e della riproduzione. Nei Vertebrati inferiori l’organo pineale contiene fotorecettori la cui attività mette in moto un orologio endogeno circadiano e regola la trascrizione nei pinealociti.

Dalla letteratura sono noti geni caratterizzati da una trascrizione che varia con un robusto ritmo giorno-notte. Recentemente sono stati identificati alcuni geni chiave dell’orologio circadiano, il cui nucleo è costituito dai fattori di trascrizione Clock e Bmal1.Tuttavia poco si sa sui meccanismi che regolano l’espressione di questi geni sia temporalmente che spazialmente.

Nel mio lavoro di tesi ho analizzato l’espressione e la funzione di Bsx (Brain Specific homeobox), un nuovo gene homeobox espresso nell’organo pineale dell’anfibio anuro Xenopus laevis. Bsx, omologo di Bsh di Drosophila melanogaster , è un gene altamente conservato, isolato infatti oltre che in Xenopus laevis anche in topo e uomo.L’omeodominio di Bsx è caratterizzato dalla presenza in posizione 50 di un residuo di glutammina specifico di molti membri della famiglia homeobox come i geni Hox della classe Antennapedia.

Ho inizialmente determinato il profilo di espressione di Xbsx durante lo sviluppo embrionale, attraverso ibridazioni in situ su embrioni interi (whole mount) e sezioni in paraffina, confrontandolo con l’espressione di geni notoriamente trascritti nel complesso pineale, quali Xrx1, Otx5 e XNot2.

Xbsx è già presente a stadio di neurula precoce con una marcatura localizzata in poche cellule disposte bilateralmente nel Diencefalo dorsale presuntivo; successivamente, con la chiusura del tubo neurale, si osserva la fusione delle due aree di espressione lungo la linea mediana proprio in corrispondenza della regione che darà origine all’organo pineale

Qui l’espressione di Xbsx perdura per tutto lo sviluppo embrionale, continuando ad essere presente anche nel girino. Xbsx può essere quindi considerato uno dei marcatori più precoci dell’organo pineale.

Successivamente ho voluto analizzare quali fossero i fattori che regolano l’espressione di Xbsx. Come potenziali regolatori ho analizzato Xrx1, Otx5 e Xnot2 valutandone la capacità di attivare l’espressione di Xbsx tramite microiniezione del loro mRNA in embrioni precoci.

In seguito alla sovraespressione di Xrx1 e di Xnot2 si osservano aree di attivazione ectopica di Xbsx in regioni prosencefaliche, con una frequenza che aumenta in maniera dose-dipendente. Al contrario la microiniezione di Xotx5 induce espressione ectopica di Xbsx solo debolmente ed a bassa frequenza.

Per capire se Xbsx svolga un ruolo nello sviluppo del complesso pineale, ho effettuato esperimenti di microiniezione del suo mRNA e analizzato eventuali cambiamenti nell’espressione di Otx5, XNot2 e Xrx1. I dati ottenuti non hanno mostrato modificazioni rilevanti nell’espressione di questi due marcatori e questo sembra quindi indicare che Xbsx non sia sufficiente da solo a specificare il territorio che darà origine all’organo pineale.

Vista l’espressione così specifica di Bsx nell’organo pineale, una possibile ipotesi è che possa essere coinvolto nella regolazione dei ritmi circadiani. Per saggiare questa ipotesi è necessario avere come riferimento geni la cui espressione nella pineale è caratterizzata da variazioni cicliche legate ai ritmi circadiani. I marcatori principalmente usati per questo scopo sono Aanat (N-acetyltransferase) e Irbp (Interphotoreceptor binding protein) descritti in diversi sistemi modello ma non ancora isolati in Xenopus laevis. Mediante una ricerca effettuata in banche dati ho individuato gli omologhi di Xenopus di questi due geni e, tramite ibridazioni in situ, ne ho verificato l’espressione nell’organo pineale.

Successivamente ho verificato la loro espressione ritmica tramite ibridazione in situ whole-mount effettuata direttamente su cervelli di Xenopus prelevati a stadio 46.

I risultati ottenuti nell’ esperimento hanno evidenziato chiaramente la capacità del geneAanat2 di rispondere in maniera ciclica a ritmi costanti di luce/buio.