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Lo sviluppo dell’ occhio segue una serie di eventi sequenziali che richiede segnali induttivi spazialmente e temporalmente specifici e precisi movimenti morfogenetici: nello specifico, la prima evidenza morfologica si ha nel momento in cui le pareti laterali del cervello anteriore evaginano per dare origine bilateralmente alle vescicole ottiche, dalle quali deriveranno tutte le strutture neurali dell’ occhio, quali sono la retina, l’ epitelio pigmentato e il peduncolo ottico.

Attraverso l’induzione cooperativa di segnali planari e verticali, l’ectoderma che sovrasta la vescicola ottica differenzia in cornea e placode e del cristallino, il quale a sua volta induce la vescicola ottica stessa a invaginarsi in una coppa ottica costituita da uno strato interno e uno esterno, destinati a diventare, al termine dei rispettivi processi differenziativi, retina ed epitelio pigmentato.

In Xenopus laevis è dimostrato che le cellule posteriori della piastra neurale iniziano a differenziare alla fine della gastrulazione, laddove quelle più anteriori,ossia il territorio che viene determinato dai seguenti eventi di neurulazione a formare retina e cervello anteriore, manifestano un periodo proliferativo più esteso e vanno incontro a neurogenesi solo allo stadio di bottone caudale.

Xrx1 è un gene appartenente alla famiglia degli homeobox paired-like: dotato di un dominio di legame al DNA di tipo paired e di un dominio carbossiterminale OAR di transattivazione, è espresso nella piastra neurale anteriore a partire dallo stadio di gastrula tardiva e a seguire in retina neurale, epitelio pigmentato, ghiandola pineale, diencefalo ed epifisi. Gli esperimenti di sovraespressione e inattivazione funzionale dimostrano che Xrx1 è necessario per un corretto sviluppo dell’ occhio e del cervello anteriore.

In particolare, non essendo ancora possibile eliminare selettivamente singoli geni in Xenopus, l’inattivazione funzionale di Xrx1 è stata finora realizzata mediante la microiniezione in singoli blastomeri di mRNA del costrutto dominante negativo Xrx1-Enr. I fenotipi generati manifestano riduzioni di gravità variabile nelle strutture cefaliche anteriori, fino a giungere alla loro completa ablazione. Questo approccio risente tuttavia di importanti limitazioni, dato che la proteina endogena di Xrx1 continua a essere regolarmente prodotta, edentra in competizione funzionale con il dominante negativo iniettato.

Lo scopo di questa tesi è la validazione di un nuovo approccio per l’inattivazione funzionale di Xrx1, mediante l’utilizzo di un oligonucleotide antisenso Morpholino. La peculiare costituzione chimica fa si che un oligo Morpholino accuratamente disegnato blocchi la traduzione dell’RNA messaggero a cui si appaia causando un impedimento sterico al cammino del ribosoma lungo il filamento di mRNA. La reale efficacia e specificità dell’oligonucleotide Morpholino MoXrx1, diretto contro la regione immediatamente a valle del codone di inizio del gene Xrx1, è stata studiata sia quantitativamente che funzionalmente mediante differenti approcci sperimentali.

Tramite PCR e successivo clonaggio in vettore plasmidico, sono stati realizzati due costrutti, denominati Xrx1-Mt e Mt-Xrx1, ognuno dotato di un Myctag rispettivamente posto al 5’ oppure al 3’ della sequenza codificante del cDNA di Xrx1. Nel caso del costrutto Xrx1-Mt la sequenza bersaglio per MoXrx1 contiene il primo codone di inizio della proteina chimerica, mentre nel costrutto Mt-Xrx1 la sequenza bersaglio e’ in una regione interna del cDNA. Dopo trascrizione in vitro, l’ mRNA di tali costrutti è stato microiniettato in embrioni di Xenopus laevis, in singoli blastomeri dorsali. Sono state effettuate microiniezioni di ciascun singolo trascritto, oppure co-iniezioni dei trascritti insieme a MoXrx1 o alternativamente a un oligonucleotide di controllo negativo. La traduzione dei singoli costrutti è stata valutata mediante SDS-PAGE seguita da western blotting di estratti proteici dei differenti embrioni microiniettati. La rivelazione delle bande proteiche per chemoluminescenza mostra che la coiniezione di MoXrx1 abolisce la traduzione di Xrx1-Mt, ma non quella di Mt-Xrx1, e dimostra l’efficacia e la specificità di azione di MoXrx1 dipendente dalla posizione della sequenza bersaglio.

Mediante ibridazione in situ su embrioni interi (whole mount) sono state inoltre studiate le alterazioni indotte dalla microiniezione di MoXrx1 sull’espressione di geni coinvolti nel ciclo cellulare (Cyclin D1, P27, Gadd-45), nella neurogenesi (Xhairy2, Xngn-r,Elr-C) e nel patterning (Fez, XBf-1, Xpax6, Xrx1,Xotx2,Xanf-1,Pax2,Xotx5, FGF-8) della piastra neurale anteriore.

I risultati ottenuti, confermano le proprietà dell’oligonucleotide MoXrx1 di inibitore efficace e specifico della traduzione di Xrx1 e ne rendono possibile un suo futuro utilizzo nella costruzione di una libreria sottrattiva finalizzata alla ricerca di geni bersaglio a valle nella cascata d attivazione trascrizionale di Xrx1stesso.