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Tesi etd-04082010-095330


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
CONTI, FRANCESCA
URN
etd-04082010-095330
Title
Ruolo della proteina accessoria ORF-A nell’infezione da virus dell’immunodeficienza felina
Settore scientifico disciplinare
MED/07
Corso di studi
VIROLOGIA FONDAMENTALE E CLINICA
Commissione
tutor Prof. Pistello, Mauro
Parole chiave
  • FIV
  • ORF-A
Data inizio appello
27/04/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
27/04/2050
Riassunto analitico
Lo sviluppo di vaccini contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) ha fatto uso di numerosi modelli animali per testare diversi approcci vaccinali e per caratterizzare i correlati di protezione. Tra questi, il virus dell’immunodeficienza felina (FIV) rappresenta un valido strumento, dal momento che la sindrome che esso provoca nel gatto è estremamente simile all’AIDS umana ma il virus non trasmissibile all’uomo. Inoltre, i costi necessari alla stabulazione e al mantenimento degli animali sono notevolmente inferiori rispetto a quelli dei primati non umani. Per questo motivo FIV è stato utilizzato in numerosi approcci vaccinali da utilizzare come modello per lo studio di HIV.<br>I vaccini inattivati contro agenti infettivi di solito sono costituiti dall’intero patogeno fissato o da una o più proteine strutturali. Queste strategie sono state esplorate anche contro HIV, ma, nonostante l’uso di numerosi adiuvanti e diversi metodi di somministrazione, attualmente non è ancora disponibile un vaccino efficace. Per questo motivo sono stati esplorati nuovi approcci, come l’uso di proteine regolatorie o accessorie come antigeni vaccinali. Infatti, oltre alle tre open reading frame (ORF) maggiori, gag, pol ed env, entrambi i virus codificano anche per proteine non direttamente coinvolte nel replicazione virale e per questo sono dette accessorie. HIV ne ha sei, mentre FIV solo tre: Vif, il fattore di infettività virale, Rev, coinvolta nel processamento post-trascrizionale dei messaggeri, e ORF-A. Quest’ultima è nota per essere essenziale per l’infezione di cellule linfoidi primarie, per la sua capacità transattivante e per la modulazione del ciclo cellulare. A causa delle sue caratteristiche, quindi, lo studio di questa proteina può rivelarsi estremamente utile per capire i meccanismi attraverso cui il virus infetta le cellule e si diffonde all’interno dell’ospite e può fornire importanti indicazioni sulla validità delle proteine accessorie come antigeni vaccinali.<br>Per studiare le funzioni di ORF-A, sono state prodotte versioni mutate, ottimizzate e di fusione della proteina. Tramite la proteina di fusione con GST è stato valutato il ruolo di ORF-A nella transattivazione delle LTR di FIV: il risultato ha evidenziato un più elevato livello di attività basale dei promotori di FIV se paragonato a quelli di HIV ma un’attività transattivante di ORF-A più debole rispetto a quella di Tat.<br>E’ stata inoltre analizzata la capacità di ORF-A di essere internalizzata dalle cellule circostanti, come avviene per Tat. Utilizzando una proteina di fusione GST/ORF-A/GFP è stato osservato che anche ORF-A è internalizzata e che questa caratteristica è dovuta al suo dominio basico.<br>A causa dei bassi livelli di espressione di questa proteina e della difficoltà di utilizzare linfociti e macrofagi, target naturali di infezione da FIV, la maggior parte degli studi precedenti sono stati effettuati in fibroblasti felini, più facili da manipolare ma nei quali ORF-A non è necessaria per una corretta replicazione del virus ed ha probabilmente localizzazione diversa. Per superare questo problema e valutare l’attività della proteina in cellule linfoidi ne è stata prodotta una versione ottimizzata, la cui espressione è decisamente maggiore rispetto alla forma wild-type. Inoltre, per valutare il suo ruolo durante la replicazione virale, sono stati testati diversi cloni di FIV in cui la proteina risultava mutata o assente. Questi mutanti sono stati utilizzati per infettare cellule feline quali fibroblasti, linfociti, primari e non, e macrofagi.<br>La forma ottimizzata è stata anche utilizzata in studi con il microscopio confocale per valutare la localizzazione intracellulare della proteina, che è risultata essere di tipo nucleare.<br>In conclusione, gli studi effettuati contribuiscono a definire le caratteristiche principali di ORF-A, l’unica delle proteine di FIV la cui funzione non è ancora stata chiarita in dettaglio. I risultati ottenuti delineano una proteina multifunzionale (caratteristica condivisa da molte proteine di virus con genomi di piccole dimensioni come FIV), che si è rivelata essenziale per la replicazione nelle cellule target dell’infezione e che potrebbe rappresentare un buon target per eventuali strategie terapeutiche e profilattiche.<br>
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