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Tesi etd-04082004-140749


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Parra, Riccardo
email address
kuros_ironfield@libero.it
URN
etd-04082004-140749
Title
Analisi funzionale del C-terminale di Xotx2 e Xotx5 nello sviluppo precoce di Xenopus laevis
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Supervisors
relatore Vignali, Robert
Parole chiave
  • estensione convergente
  • gastrulazione
  • onde calcio
  • wnt
  • otx2
Data inizio appello
04/05/2004;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
04/05/2044
Riassunto analitico
<p class=MsoNormal style='text-align:justify'>I geni <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Otx</i> dei Vertebrati, omologhi <span class=GramE>di </span><i
style='mso-bidi-font-style:normal'>orthodenticle</i> (<i style='mso-bidi-font-style:
normal'>otd</i>) di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Drosophila</i>,
svolgono un ruolo di primaria importanza nella specificazione della regione
rostrale del sistema nervoso centrale (SNC) dei Vertebrati. Studi su questi
geni sono stati condotti dapprima in topo dove sono stati inizialmente
caratterizzati <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Otx1</i> e <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Otx2</i>. <span class=GramE>Successivamente</span>
sono stati isolati <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Otx3</i> in Zebrafish
e <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx1, Xotx2,</i> <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx4</i> ed <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx5</i> in <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xenopus laevis</i>. Nei mammiferi <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>otx5</i> non è presente, ma si trova un
altro gene della famiglia <i style='mso-bidi-font-style:normal'>otx</i> detto <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>crx</i> (cone rod homeobox), la cui
relazione con <i style='mso-bidi-font-style:normal'>otx5</i> non è
definitivamente chiarita. <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Crx</i> è
implicato nello sviluppo dell’occhio e mutazioni di <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Crx</i> provocano nell’uomo diverse malattie della retina, che
comprendono l’amaurosi congenita di Leber (una grave degenerazione dei coni e
dei bastoncelli nell’infanzia), la distrofia dei coni e dei bastoncelli
nell’adulto e la retinite pigmentosa.</p>

<p class=MsoNormal style='text-align:justify'>In questo lavoro di tesi <span
class=GramE>abbiamo concentrato la nostra attenzione sui geni <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx2</i> e <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx5</i> di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xenopus</i>,
nell’ambito di un progetto di ricerca rivolto</span> a chiarire il loro ruolo
nello sviluppo dell’occhio. <span class=GramE>Come tutti i geni della classe <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>otd/otx</i>, <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx2</i> e <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx5</i> contengono
un omeodominio della classe bicoid, caratterizzato da uno specifico residuo di
lisina in posizione 50 (corrispondente alla posizione 9 dell’elica di
riconoscimento) che conferisce loro la specificità di legame al DNA</span>.
Esperimenti condotti in topo hanno mostrato che <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Otx2</i> è espresso nell’intero epiblasto <span class=GramE>di </span>embrioni
precoci. <span class=GramE>Successivamente</span> la sua espressione diviene sempre
più ristretta alle regioni più anteriori che includono il neuroectoderma
corrispondente alle regioni telencefaliche, diencefaliche e mesencefaliche. A <span
class=GramE>sottolineare</span> l’importanza di tale gene vi è il fatto che
topi <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Otx2<sup>-/-</sup></i> muoiono
precocemente nell’embriogenesi per la totale assenza di tali strutture e per
malformazioni generalizzate del piano corporeo (dovuti a movimenti anomali
durante la gastrulazione). L’espressione di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx2</i>
nell’embriogenesi di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xenopus</i> è simile
a <span class=GramE>quella </span>osservata nel topo, ed interessa inizialmente
la regione dell’organizzatore di Spemann, e successivamente le regioni rostrali
del SNC, incluso l’occhio.</p>

<p class=MsoNormal style='text-align:justify'>Dal canto suo <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx5</i> ha un’espressione nell’embrione
precoce simile a quella di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx2</i>. Si
trova<span class=GramE> infatti</span> nella regione dell’organizzatore di
Spemann allo stadio di gastrula precoce e, poco dopo, anche nel neurectoderma
anteriore. <span class=GramE>Successivamente</span> alla chiusura del tubo
neurale però, si ritrova esclusivamente espresso nell’occhio e nella ghiandola
pineale, entrambe strutture deputate alla fotorecezione. Esperimenti di
sovraespressione in embrioni precoci hanno mostrato effetti simili alla
sovraespressione di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx2</i>, producendo
riduzioni delle strutture posteriori e l’induzione di strutture anteriori e
tessuto neurale nell’intero embrione. </p>

<p class=MsoNormal>L’espressione di questi geni durante lo sviluppo dell’occhio
ha spinto <span class=GramE>a</span> ulteriori approfondimenti che hanno
mostrato il ruolo chiave dei due geni nel differenziamento di tale struttura. <span
class=GramE>Infatti</span> l’espressione di <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx5</i>,
durante lo sviluppo dell’occhio si restringe progressivamente sia alle cellule
bipolari che ai fotorecettori. Invece l’espressione di <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx2</i> <span class=GramE>viene</span> progressivamente ristretta
alle sole cellule bipolari. Esperimenti di lipotrasfezione di precursori
retinici con costrutti per i due geni mostrano che <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx2</i> spinge i precursori verso un destino bipolare, mentre <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx5</i> spinge le cellule verso un destino
di fotorecettori. Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di
analizzare l’importanza delle varie porzioni del C-terminale nell’azione <span
class=GramE>di</span> transattivazione di questi fattori di trascrizione. A
questo scopo, si è provveduto alla creazione di vari costrutti <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xotx2</i> e <i style='mso-bidi-font-style:
normal'>Xotx5</i>, deleti al C-terminale, tramite PCR. <span class=GramE>Successivamente</span>,
il loro mRNA è stato trascritto “in vitro” e microiniettato in embrioni di <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>Xenopus</i> allo stadio di 4 blastomeri. Gli
embrioni sono stati poi caratterizzati in base al fenotipo osservato e
sottoposti ad analisi con opportuni markers molecolari allo scopo di
evidenziare strutture ectopiche indotte in seguito all’iniezione. L’analisi degli
effetti di tali costrutti è preliminare a successivi esperimenti di
lipotrasfezione di precursori cellulari retinici; l’intento è di identificare
quali domini funzionali di Xotx2 e Xotx5 siano essenziali per la loro azione di
specificazione di tipi cellulari in retina.</p>