Tesi etd-04082004-140749

Tipo di tesi

Tesi di laurea vecchio ordinamento

Autore

Parra, Riccardo

Indirizzo email

kuros_ironfield@libero.it

URN

etd-04082004-140749

Titolo

Analisi funzionale del C-terminale di Xotx2 e Xotx5 nello sviluppo precoce di Xenopus laevis

Dipartimento

SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

Corso di studi

SCIENZE BIOLOGICHE

Relatori

relatore Vignali, Robert

Parole chiave

estensione convergente
gastrulazione
onde calcio
otx2
wnt

Data inizio appello

04/05/2004

Consultabilità

Parziale

Data di rilascio

04/05/2044

Riassunto

I geni Otx dei Vertebrati, omologhi di orthodenticle (otd) di Drosophila,
svolgono un ruolo di primaria importanza nella specificazione della regione
rostrale del sistema nervoso centrale (SNC) dei Vertebrati. Studi su questi
geni sono stati condotti dapprima in topo dove sono stati inizialmente
caratterizzati Otx1 e Otx2. Successivamente
sono stati isolati Otx3 in Zebrafish
e Xotx1, Xotx2, Xotx4 ed Xotx5 in Xenopus laevis. Nei mammiferi otx5 non è presente, ma si trova un
altro gene della famiglia otx detto crx (cone rod homeobox), la cui
relazione con otx5 non è
definitivamente chiarita. Crx è
implicato nello sviluppo dell’occhio e mutazioni di Crx provocano nell’uomo diverse malattie della retina, che
comprendono l’amaurosi congenita di Leber (una grave degenerazione dei coni e
dei bastoncelli nell’infanzia), la distrofia dei coni e dei bastoncelli
nell’adulto e la retinite pigmentosa.

In questo lavoro di tesi abbiamo concentrato la nostra attenzione sui geni Xotx2 e Xotx5 di Xenopus,
nell’ambito di un progetto di ricerca rivolto a chiarire il loro ruolo
nello sviluppo dell’occhio. Come tutti i geni della classe otd/otx, Xotx2 e Xotx5 contengono
un omeodominio della classe bicoid, caratterizzato da uno specifico residuo di
lisina in posizione 50 (corrispondente alla posizione 9 dell’elica di
riconoscimento) che conferisce loro la specificità di legame al DNA.
Esperimenti condotti in topo hanno mostrato che Otx2 è espresso nell’intero epiblasto di embrioni
precoci. Successivamente la sua espressione diviene sempre
più ristretta alle regioni più anteriori che includono il neuroectoderma
corrispondente alle regioni telencefaliche, diencefaliche e mesencefaliche. A sottolineare l’importanza di tale gene vi è il fatto che
topi Otx2-/- muoiono
precocemente nell’embriogenesi per la totale assenza di tali strutture e per
malformazioni generalizzate del piano corporeo (dovuti a movimenti anomali
durante la gastrulazione). L’espressione di Xotx2
nell’embriogenesi di Xenopus è simile
a quella osservata nel topo, ed interessa inizialmente
la regione dell’organizzatore di Spemann, e successivamente le regioni rostrali
del SNC, incluso l’occhio.

Dal canto suo Xotx5 ha un’espressione nell’embrione
precoce simile a quella di Xotx2. Si
trova infatti nella regione dell’organizzatore di
Spemann allo stadio di gastrula precoce e, poco dopo, anche nel neurectoderma
anteriore. Successivamente alla chiusura del tubo
neurale però, si ritrova esclusivamente espresso nell’occhio e nella ghiandola
pineale, entrambe strutture deputate alla fotorecezione. Esperimenti di
sovraespressione in embrioni precoci hanno mostrato effetti simili alla
sovraespressione di Xotx2, producendo
riduzioni delle strutture posteriori e l’induzione di strutture anteriori e
tessuto neurale nell’intero embrione. 

L’espressione di questi geni durante lo sviluppo dell’occhio
ha spinto a ulteriori approfondimenti che hanno
mostrato il ruolo chiave dei due geni nel differenziamento di tale struttura. Infatti l’espressione di Xotx5,
durante lo sviluppo dell’occhio si restringe progressivamente sia alle cellule
bipolari che ai fotorecettori. Invece l’espressione di Xotx2 viene progressivamente ristretta
alle sole cellule bipolari. Esperimenti di lipotrasfezione di precursori
retinici con costrutti per i due geni mostrano che Xotx2 spinge i precursori verso un destino bipolare, mentre Xotx5 spinge le cellule verso un destino
di fotorecettori. Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di
analizzare l’importanza delle varie porzioni del C-terminale nell’azione di transattivazione di questi fattori di trascrizione. A
questo scopo, si è provveduto alla creazione di vari costrutti Xotx2 e Xotx5, deleti al C-terminale, tramite PCR. Successivamente,
il loro mRNA è stato trascritto “in vitro” e microiniettato in embrioni di Xenopus allo stadio di 4 blastomeri. Gli
embrioni sono stati poi caratterizzati in base al fenotipo osservato e
sottoposti ad analisi con opportuni markers molecolari allo scopo di
evidenziare strutture ectopiche indotte in seguito all’iniezione. L’analisi degli
effetti di tali costrutti è preliminare a successivi esperimenti di
lipotrasfezione di precursori cellulari retinici; l’intento è di identificare
quali domini funzionali di Xotx2 e Xotx5 siano essenziali per la loro azione di
specificazione di tipi cellulari in retina.

File

Nome file	Dimensione
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01_Indice.pdf	78.77 Kb
02_Riassunto.pdf	21.06 Kb
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06_Strut...e_otx.pdf	136.54 Kb
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25_Costr...erati.pdf	95.71 Kb
26_Embri...nopus.pdf	24.53 Kb
27_Micro...zioni.pdf	13.69 Kb
28_Sinte...ritti.pdf	16.41 Kb
29_Beta-gal.pdf	111.69 Kb
30_Whole-Mount.pdf	75.53 Kb
34_Bibliografia.pdf	113.72 Kb
35_Ringr...menti.pdf	10.18 Kb
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