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Tesi etd-04072017-143815


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
BARSUGLIA, FRANCESCA
URN
etd-04072017-143815
Title
Sintesi e valutazione biologica di analoghi del resveratrolo quali stabilizzatori della struttura tetramerica della Transtiretina
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Orlandini, Elisabetta
relatore Dott.ssa Nencetti, Susanna
Parole chiave
  • TTR
  • T4
  • amiloidosi
  • resveratrolo
Data inizio appello
27/04/2017;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
27/04/2020
Riassunto analitico
La Transtiretina (TTR) è una proteina plasmatica di trasporto presente in mammiferi,
uccelli e rettili. Questa proteina è coinvolta nel trasporto dell’ormone tiroideo Tiroxina
(T4) e del Retinolo (vitamina A) complessato con la retinol binding protein (RBP) nel
plasma umano e nel fluido cerebrospinale (CSF). La TTR viene principalmente sintetizzata
a livello del fegato e del plesso corioideo nel cervello e, in misura minore, a livello della
retina e della placenta umana, ed è presente sia nel plasma umano sia nel CSF in
concentrazioni differenti. La TTR è una proteina omotetramerica con un peso molecolare
di circa 55 kDa, caratterizzata da quattro identiche subunità, ciascuna costituita da 127
residui amminoacidici. Il tetramero forma una tasca idrofobica centrale che include due
siti di legame per l’ormone tiroideo T4, i quali hanno una forma ad imbuto e sono
localizzati all’interfaccia dimero-dimero (A,B/C,D). Ciascun sito di legame per T4 è
caratterizzato da due sottositi simmetrici, all’interno dei quali è possibile riconoscere una
piccola cavità interna “inner binding pocket”, una cavità esterna più grande “outer
binding pocket” e tre tasche di legame per gli alogeni “halogen binding pockets” (HBPs),
le quali sono in grado di accogliere gli atomi di iodio del ligando naturale. In
condizioni normali, la TTR circola nel plasma come una innocua proteina solubile, ma in
alcuni individui questa tende a formare delle fibrille amiloidi che sono associate con
diverse malattie, le amiloidosi.Le amiloidosi sono patologie nelle quali alcune proteine plasmatiche normalmente
solubili si vanno a depositare nello spazio extracellulare sotto forma di fibrille insolubili,
dette amiloidi. La moderna classificazione delle forme di amiloidosi si basa sulla natura
delle proteine plasmatiche precursori che determinano la formazione di depositi fibrillari:
 AL amiloidosi: Le fibrille amiloidi derivano dalle catene leggere della regione
variabile di anticorpi monoclonali, prodotti da plasmacellule che si trovano nel midollo
osseo.
 AA amiloidosi: Le fibrille amiloidi derivano da frammenti di scissione della proteina
siero amiloide A (SAA), una proteina di fase acuta prodotta in risposta ad
infiammazione.
 ATTR amiloidosi: La dissociazione del tetramero della TTR è il passaggio limitante per
l’amiloidogenesi, con l’ottenimento dei singoli monomeri nativi, i quali possono
riassociarsi per ottenere il tetramero oppure possono subire una parziale
denaturazione per dare monomeri amiloidogenici, che si assemblano dando origine
alle fibrille amiloidi. Sono stati riconosciuti 4 tipi di amiloidosi:
 Amiloidosi sistemica senile (SSA): Nella SSA è coinvolta la TTR wild-type (WT-TTR),
che va incontro al processo di fibrillogenesi, favorendo la deposizione di fibrille
amiloidi in vari tessuti.
 Polineuropatia amiloide familiare (FAP): Amiloidosi ereditaria in cui forme mutate
della TTR si aggregano a formare fibrille amiloidi che si vanno a depositare
soprattutto a livello del sistema nervoso periferico. La mutazione più
comunemente associata alla FAP è Val30Met.
 Cardiomiopatia amiloide familiare (FAC): Amiloidosi ereditaria in cui le fibrille
amiloidi prodotte da forme mutate della TTR si vanno a depositare soprattutto a
livello cardiaco. La mutazione più comune è Val122Ile.
 Amiloidosi selettiva del SNC (CNSA): Amiloidosi ereditaria che colpisce
prevalentemente il Sistema nervoso centrale. Approssimativamente 13 diverse
mutazioni della TTR, come Asp18Gly e Ala23Thr, sono state associate con lo
sviluppo di CNSA nell’uomo.
Poichè il fegato è il maggior sito di sintesi della TTR, una strategia terapeutica efficace per
migliorare l'amiloidosi da TTR è il trapianto ortotopico di fegato. Sfortunatamente questa
terapia porta numerosi rischi per il paziente e non è efficace per tutte le forme di
amiloidosi. E’ stato necessaro, quindi, sviluppare una diversa terapia, non invasiva, per
prevenire la formazione delle fibrille o per distruggere le fibrille già formate. La
conoscenza della struttura intermedia degli aggregati formanti le fibrille, ha permesso la
progettazione di molecole capaci di legarsi al tetramero della TTR, inibendo la sua
dissociazione e quindi la formazione di specie amiloidogeniche. I composti studiati
possono essere classificati in: Analoghi degli ormoni tiroidei, Composti non naturali,
Composti naturali.
Tra i composti non naturali, i più importanti sono: Diflunisal, farmaco anti-infiammatorio
non steroideo approvato dalla FDA, che attualmente è sotto sperimentazione clinica in
pazienti con FAP; Tafamidis, derivato benzossazolico che ha mostrato un’eccellente
attività inibitoria e un’elevata selettività per la TTR. Quest’ultimo è stato approvato
dall’European Medicines Agency nel 2011 e dalla Japanese Pharmaceuticals and Medical
Devices Agency nel 2013 per il trattamento di pazienti affetti da FAP al primo stadio, ma
non è ancora stato approvato dalla FDA.
Tra i composti naturali, molto importanti sono i derivati polifenolici, come il Resveratrolo
e l’Epigallocatechina 3-gallato, che hanno la capacità di stabilizzare la struttura
tetramerica della TTR. L’Epigallocatechina 3-gallato (EGCG) è il principale polifenolo
presente nel tè verde; questo composto ha la capacità di inibire la dissociazione del
tetramero della TTR e soprattutto di mantenere la TTR come proteina solubile. Nella TTR
sono stati identificati 3 siti di legame per EGCG, distinti dal sito di legame per T4: ciò indica
che EGCG può stabilizzare anche quelle varianti della TTR che, avendo una mutazione
intorno al sito di legame per T4 , sono refrattarie agli effetti stabilizzatori della tiroxina.
Il Resveratrolo è un derivato stilbenico particolarmente abbondante nel vino rosso; si
adatta bene nel sito di legame per T4 della TTR, stabilizzando il tetramero e, quindi,
inibendo la formazione di fibrille amiloidi.
Nel mio lavoro di tesi sono stati sintetizzati nuovi analoghi del resveratrolo che
presentano una struttura generale come mostrato in figura 3, nella quale possiamo
individuare due porzioni aromatiche variamente sostituite collegate fra loro attraverso un
linker etero atomico. I composti sintetizzati sono stati caratterizzati per mezzo della
spettroscopia 1H-NMR e sottoposti a valutazione biologica mediante un saggio
turbidimetrico in vitro UV-vis che permette di valutare la capacità delle molecole
sintetizzate di inibire la formazione di fibrille derivanti dal misfolding della proteina
transtiretina.
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