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Thesis etd-04072017-143815


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
BARSUGLIA, FRANCESCA
URN
etd-04072017-143815
Thesis title
Sintesi e valutazione biologica di analoghi del resveratrolo quali stabilizzatori della struttura tetramerica della Transtiretina
Department
FARMACIA
Course of study
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Orlandini, Elisabetta
relatore Dott.ssa Nencetti, Susanna
Keywords
  • T4
  • resveratrolo
  • amiloidosi
  • TTR
Graduation session start date
27/04/2017
Availability
Withheld
Release date
27/04/2087
Summary
La Transtiretina (TTR) è una proteina plasmatica di trasporto presente in mammiferi, uccelli e rettili. Questa proteina è coinvolta nel trasporto dell’ormone tiroideo Tiroxina (T4) e del Retinolo (vitamina A) complessato con la retinol binding protein (RBP) nel plasma umano e nel fluido cerebrospinale (CSF). La TTR viene principalmente sintetizzata a livello del fegato e del plesso corioideo nel cervello e, in misura minore, a livello della retina e della placenta umana, ed è presente sia nel plasma umano sia nel CSF in concentrazioni differenti. La TTR è una proteina omotetramerica con un peso molecolare di circa 55 kDa, caratterizzata da quattro identiche subunità, ciascuna costituita da 127 residui amminoacidici. Il tetramero forma una tasca idrofobica centrale che include due siti di legame per l’ormone tiroideo T4, i quali hanno una forma ad imbuto e sono localizzati all’interfaccia dimero-dimero (A,B/C,D). Ciascun sito di legame per T4 è caratterizzato da due sottositi simmetrici, all’interno dei quali è possibile riconoscere una piccola cavità interna “inner binding pocket”, una cavità esterna più grande “outer binding pocket” e tre tasche di legame per gli alogeni “halogen binding pockets” (HBPs), le quali sono in grado di accogliere gli atomi di iodio del ligando naturale. In condizioni normali, la TTR circola nel plasma come una innocua proteina solubile, ma in alcuni individui questa tende a formare delle fibrille amiloidi che sono associate con diverse malattie, le amiloidosi.Le amiloidosi sono patologie nelle quali alcune proteine plasmatiche normalmente solubili si vanno a depositare nello spazio extracellulare sotto forma di fibrille insolubili, dette amiloidi. La moderna classificazione delle forme di amiloidosi si basa sulla natura delle proteine plasmatiche precursori che determinano la formazione di depositi fibrillari:
 AL amiloidosi: Le fibrille amiloidi derivano dalle catene leggere della regione variabile di anticorpi monoclonali, prodotti da plasmacellule che si trovano nel midollo osseo.
 AA amiloidosi: Le fibrille amiloidi derivano da frammenti di scissione della proteina siero amiloide A (SAA), una proteina di fase acuta prodotta in risposta ad infiammazione.
 ATTR amiloidosi: La dissociazione del tetramero della TTR è il passaggio limitante per l’amiloidogenesi, con l’ottenimento dei singoli monomeri nativi, i quali possono riassociarsi per ottenere il tetramero oppure possono subire una parziale denaturazione per dare monomeri amiloidogenici, che si assemblano dando origine alle fibrille amiloidi. Sono stati riconosciuti 4 tipi di amiloidosi:
 Amiloidosi sistemica senile (SSA): Nella SSA è coinvolta la TTR wild-type (WT-TTR), che va incontro al processo di fibrillogenesi, favorendo la deposizione di fibrille amiloidi in vari tessuti.
 Polineuropatia amiloide familiare (FAP): Amiloidosi ereditaria in cui forme mutate della TTR si aggregano a formare fibrille amiloidi che si vanno a depositare soprattutto a livello del sistema nervoso periferico. La mutazione più comunemente associata alla FAP è Val30Met.
 Cardiomiopatia amiloide familiare (FAC): Amiloidosi ereditaria in cui le fibrille amiloidi prodotte da forme mutate della TTR si vanno a depositare soprattutto a livello cardiaco. La mutazione più comune è Val122Ile.
 Amiloidosi selettiva del SNC (CNSA): Amiloidosi ereditaria che colpisce prevalentemente il Sistema nervoso centrale. Approssimativamente 13 diverse mutazioni della TTR, come Asp18Gly e Ala23Thr, sono state associate con lo sviluppo di CNSA nell’uomo.
Poichè il fegato è il maggior sito di sintesi della TTR, una strategia terapeutica efficace per migliorare l'amiloidosi da TTR è il trapianto ortotopico di fegato. Sfortunatamente questa terapia porta numerosi rischi per il paziente e non è efficace per tutte le forme di amiloidosi. E’ stato necessaro, quindi, sviluppare una diversa terapia, non invasiva, per prevenire la formazione delle fibrille o per distruggere le fibrille già formate. La conoscenza della struttura intermedia degli aggregati formanti le fibrille, ha permesso la progettazione di molecole capaci di legarsi al tetramero della TTR, inibendo la sua dissociazione e quindi la formazione di specie amiloidogeniche. I composti studiati possono essere classificati in: Analoghi degli ormoni tiroidei, Composti non naturali, Composti naturali.
Tra i composti non naturali, i più importanti sono: Diflunisal, farmaco anti-infiammatorio non steroideo approvato dalla FDA, che attualmente è sotto sperimentazione clinica in pazienti con FAP; Tafamidis, derivato benzossazolico che ha mostrato un’eccellente attività inibitoria e un’elevata selettività per la TTR. Quest’ultimo è stato approvato dall’European Medicines Agency nel 2011 e dalla Japanese Pharmaceuticals and Medical Devices Agency nel 2013 per il trattamento di pazienti affetti da FAP al primo stadio, ma non è ancora stato approvato dalla FDA.
Tra i composti naturali, molto importanti sono i derivati polifenolici, come il Resveratrolo e l’Epigallocatechina 3-gallato, che hanno la capacità di stabilizzare la struttura tetramerica della TTR. L’Epigallocatechina 3-gallato (EGCG) è il principale polifenolo presente nel tè verde; questo composto ha la capacità di inibire la dissociazione del tetramero della TTR e soprattutto di mantenere la TTR come proteina solubile. Nella TTR sono stati identificati 3 siti di legame per EGCG, distinti dal sito di legame per T4: ciò indica che EGCG può stabilizzare anche quelle varianti della TTR che, avendo una mutazione intorno al sito di legame per T4 , sono refrattarie agli effetti stabilizzatori della tiroxina. Il Resveratrolo è un derivato stilbenico particolarmente abbondante nel vino rosso; si adatta bene nel sito di legame per T4 della TTR, stabilizzando il tetramero e, quindi, inibendo la formazione di fibrille amiloidi.
Nel mio lavoro di tesi sono stati sintetizzati nuovi analoghi del resveratrolo che presentano una struttura generale come mostrato in figura 3, nella quale possiamo individuare due porzioni aromatiche variamente sostituite collegate fra loro attraverso un linker etero atomico. I composti sintetizzati sono stati caratterizzati per mezzo della spettroscopia 1H-NMR e sottoposti a valutazione biologica mediante un saggio turbidimetrico in vitro UV-vis che permette di valutare la capacità delle molecole sintetizzate di inibire la formazione di fibrille derivanti dal misfolding della proteina transtiretina.
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