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Le malattie cardiovascolari sono una delle maggiori cause di morte nel mondo. Poiché uno dei fattori di rischio più incisivi è l’iperlipidemia, c’è un grande interesse a sviluppare nuove terapie farmacologiche e nuovi trattamenti per controllare il livello di lipidi nel sangue. Per pazienti che soffrono di ipercolesterolemia familiare omozigote, uno dei trattamenti che riesce a mantenere dei livelli di lipidi nel sangue accettabili, secondo le linee guida europee è l’LDL-aferesi in combinazione con la terapia farmacologica. I macchinari usati per LDL-aferesi presentano una lunga serie di sensori ma uno dei più importanti è quello per il controllo delle perdite ematiche (BLD) dovute in primo luogo alla rottura delle fibre del plasmafiltro. Il BLD in generale è un sensore ottico che riconosce la presenza di concentrazioni di sangue nel plasma ed è fondamentale per l’avvio di allarmi acustici e sonori nel caso di rilevazione ematica. Per il trattamento di LDL-aferesi, la presenza dei lipidi nel plasma, che creano un effetto lattiginoso e opalescente, va ad interferire con il principio di funzionamento ottico del sensore BLD, attivando gli allarmi anche in casi non pericolosi, richiedendo quindi una continua sorveglianza dell’operatore durante il trattamento. Per risolvere questo problema, l’azienda Medica S.p.a ha deciso di sviluppare un sensore BLD con alla base uno microspettrofotometro in grado di sfruttare diverse lunghezze d’onda per la rilevazione delle perdite ematiche e che potrebbe essere utile anche per la quantificazione dei parametri lipemici.
Come primo passo è stato necessario individuare e progettare un protocollo di produzione di campioni lipemici a concentrazioni crescenti. Il caso ottimo prevedeva l’utilizzo di campioni fisiologici provenienti da pazienti iperlipemici: questo però, oltre ad essere dispendioso in termini di tempo per le autorizzazioni legali, comportava anche una minor variabilità dei campioni prelevati. Si è quindi deciso di riprodurre i campioni di plasma lipemico in laboratorio. Come prima prova sono state fatte delle soluzioni di plasma con colesterolo e trigliceridi sintetici in polvere. Il limite di solubilità dei componenti lipemici si è rivelato essere troppo basso rispetto alle concentrazioni correlabili con i casi patologici dei pazienti sottoposti a LDL-aferesi: non si è riusciti ad ottenere dei campioni omogenei, anzi, era evidente la presenza di particolato all’interno delle provette di plasma, e anche facendo delle prove in ricircolo con il macchinario per LDL-aferesi e utilizzando del sangue intero non si è ottenuto nessun miglioramento; sono state comunque fatte delle misure con uno spettrofotometro da banco per caratterizzare questi componenti lipidici sia in plasma che in solvente polare.
Come secondo tentativo si è provveduto alla creazione di campioni di plasma con concentrazioni crescenti di colesterolo in polvere, esplicitamente indicato come solubile: in questo caso, mediante l’analisi dei campioni con uno spettrofotometro da banco, non sono state notate differenze tra lo spettro del plasma e lo spettro dei campioni con aggiunte di colesterolo.
In letteratura, numerosi articoli scientifici utilizzano per la creazione di campioni plasmatici lipemici, il composto Intralipid, prescritto nella pratica clinica per la nutrizione parenterale nei casi in cui sia richiesto un elevato apporto energetico. Intralipid è un composto formato da lipidi di soia e fosfolipidi di tuorlo d’uovo, per cui si è provato a realizzare dei campioni plasmatici che simulano l’interferenza lipidica tramite l’aggiunta di fosfolipidi di soia. I campioni, che già visivamente si avvicinavano all’aspetto di plasma lipemico, sono stati analizzati con lo spettrofotometro da banco che ha rilevato degli spettri caratteristici: la presenza della componente lipemica ha provocato uno scattering e quindi un offset dello spettro del plasma.
Dopo aver individuato un protocollo per la creazione dei campioni lipemici plasmatici, si è provveduto alla produzione di un database utilizzabile che comprendesse campioni a concentrazione lipidica crescente, mediante l’utilizzo dei fosfolipidi di soia, e a concentrazione di sangue variabile. I valori percentuali di sangue sono stati forniti dall’azienda in base alle soglie di detection del sangue considerate pericolose per il paziente.
Sfruttando il microspettrofotometro della scheda dell’azienda Medica S.p.a, si è fatto una folta campagna di misura: sono stati preparati campioni di plasma con 6 concentrazioni di fosfolipidi diversi e 6 concentrazioni di sangue diverse, di cui sono stati acquisiti gli spettri con il sensore e si sono ripetute più misure dello stesso campione per escludere eventuali problemi di affidabilità e ripetibilità della scheda.
Con il database creato, è stata eseguita una prima elaborazione per un’ispezione visiva degli spettri rilevati e poi si è passati allo sviluppo di un primo algoritmo molto semplice per la classificazione dei campioni su 3 soglie in base alla concentrazione di sangue: sangue non presente, piccola concentrazione di sangue e alta concentrazione di sangue. Per questo primo algoritmo sono state create due finestre di osservazione degli spettri, una per i picchi caratteristici del sangue e una per il picco principale; in queste finestre è stata calcolata l’area sotto la curva in modo che ad ogni campione corrispondessero due valori di aree. Per la classificazione si è notato che i campioni senza fosfolipidi erano molto ben distanziati rispetto ai campioni con fosfolipidi per tutte le concentrazioni di sangue: per i campioni lipemici si è applicato un SVM per la classificazione e l’individuazione delle soglie critiche di sangue mentre per i campioni plasmatici è stata sufficiente una semplice sogliatura.
Come secondo passo per lo sviluppo di un algoritmo di classificazione sono state create svariate reti neurali. Sono stati considerati 4 casi che differivano ciascuno per i dati in ingresso alla rete: prima si sono considerati gli spettri normalizzati rispetto ad una reference di soluzione fisiologica per la ripetibilità di misura tra schede diverse, poi si è considerato l’area sotto i picchi caratteristici del sangue degli spettri normalizzati e non normalizzati ed infine si sono considerate le due aree dei picchi caratteristici del sangue e del picco principale degli spettri non normalizzati. Per ciascuna delle 4 casistiche precedentemente elencate si sono sviluppate 3 reti neurali: una rete per la classificazione binaria per la presenza di sangue o meno, una rete per la classificazione delle 6 concentrazioni diverse di sangue e una rete per la classificazione contemporanea di sangue e fosfolipidi (36 classi diverse). Si è fatto un confronto tra tutte le reti in termini di accuratezza: in tutti e 4 i casi è stato possibile fare una classificazione binaria e distinguere tra campioni senza sangue o con percentuali basse di sangue e campioni con elevate percentuali di sangue, obbiettivo primario per il buon funzionamento del microspettrofotometro come sensore BLD. Sfruttando il calcolo delle 2 aree in zone caratteristiche dello spettro è stata ottenuta una buona classificazione dei campioni sia in base alla concentrazione di fosfolipidi presenti sia in base alla concentrazione di sangue. Quest’ultimo algoritmo è stato testato anche su un secondo database di misure non usato per il testing.
In conclusione, è stato sviluppato un protocollo di creazione di plasma lipemico in vitro e di un protocollo di misura ripetibile per la creazione di database confrontabili. Inoltre, si sono sviluppate diverse reti neurali che riescono a distinguere la presenza di sangue o meno nei campioni lipemici, obbiettivo primario per il funzionamento del sensore BLD basato su un microspettrofotometro per macchine di LDL-aferesi, e una rete che riesce a classificare i campioni sia in base alla concentrazione di sangue che in base alla concentrazione di fosfolipidi.