• epigenetica
• JHDM1D
• Xenopus laevis

Lo sviluppo di tutti gli organismi del Regno animale, dai meno ai più complessi, richiede una serie di processi coordinati quali determinazione, differenziamento e migrazione dei progenitori cellulari.
In particolare nel sistema nervoso dei vertebrati, questi processi sono straordinariamente complessi e si basano sull’espressione coordinata di molti geni, la cui cascata gerarchica non è ancora stata completamente chiarita. Se si considera poi l'architettura di una struttura stratificata quale è la retina, la coordinazione tra proliferazione e determinazione dei progenitori neuronali diventa cruciale.
Inoltre al signalling cellulare mediato dai regolatori principali dello sviluppo dell'occhio quali Pax6, Six3 ed Rx1, si aggiunge la regolazione di fattori epigenetici in grado di incidere sull’espressione dei geni, tramite modifiche reversibili quali acetilazione, fosforilazione e metilazione delle proteine istoniche, aggiungendo complessità alla regolazione dell’espressione genica. Il mio progetto di tesi sperimentale verte proprio sulla caratterizzazione dell’istone demetilasi JHDM1D durante lo sviluppo embrionale dell’anfibio anuro Xenopus laevis.
Nota anche col nome di KIAA1718, la JHDM1D è un enzima molto conservato tra i vertebrati e, come riportato in letteratura, riveste un ruolo importante nell’indirizzare le cellule verso un destino neurale (Huang et al., 2010a,b). Tuttavia, non esistono informazioni riguardanti il potenziale ruolo di JHDM1D nella retinogenesi. Recentemente, uno screening per microarray eseguito nel nostro laboratorio ha identificato JHDM1D come un gene attivato da Xrx1, un fattore di trascrizione responsabile del mantenimento della pluripotenza e della proliferazione delle cellule staminali nella CMZ (“ciliary marginal zone”, regione proliferativa della retina) e, a stadi più tardivi, necessario per il differenziamento dei fotorecettori. Una possibile ipotesi è che, vista la nota capacità di JHDM1D di promuovere il differenziamento neurale, questo enzima possa essere coinvolto nel passaggio successivo e cioè nel differenziamento di alcuni tipi cellulari retinici.
A questo scopo, si è cercato in bancadati un clone di cDNA di JHDM1D di Xenopus laevis contenente l’intera regione codificante. Una prima ricerca in Genbank ha selezionato una sequenza apparentemente completa, ma che un’analisi più approfondita ha rivelato contenere un introne che genera un cambio della cornice di lettura e la terminazione prematura della proteina. Utilizzando questa sequenza come base di partenza abbiamo individuato un secondo clone per il quale in banca dati erano presenti solo sequenze parziali delle regioni 5’ e 3’. Abbiamo quindi ottenuto questo clone dal consorzio NIBB e lo abbiamo completamente sequenziato. Il clone NIBB risulta completo e senza introni e la sequenza dedotta della proteina è altamente omologa alla proteina JHDM1D di Xenopus tropicalis e di altri vertebrati. Per eseguire esperimenti funzionali è stato necessario trasferire il cDNA di JHDM1D amplificato mediante PCR, nel vettore pCS2+.
Confermato il clone tramite sequenziamento, e’ stato possibile eseguire esperimenti di microiniezioni di RNA senso di JHDM1D in blastomeri dorsali a stadio di 4 cellule e di 16 cellule per valutare gli effetti sullo sviluppo retinico in termini di proliferazione e differenziamento dei vari tipi cellulari retinici. L’analisi di retine mature di girini in cui è stata sovraespressa JHDM1D indica che questa proteina è in grado di promuovere l’aumento della popolazione di fotorecettori, diminuendo le cellule bipolari, rispetto ai relativi controlli. Al contrario, la sovraespressione di questa demetilasi non sembra avere effetto a stadi precoci in cui il neuroectoderma anteriore comincia ad assumere l’identità retinica.
La JHDM1D, in definitiva, può rappresentare un valido punto di partenza per comprendere i meccanismi regolatori epigenetici sicuramente coinvolti, ma per lo più ignoti, nello sviluppo embrionale e in particolare nello sviluppo neuronale retinico dello Xenopus laevis.

ABSTRACT
The study of developing embryo has always been fashionable for all the scientists (and not only among the scientists) all over the world. Far from comprehending mechanisms surrounding the development of vertebrate, a new science has emerged since the latest ’90s; it is called “epigenetic”. It explains the role of post translational modifications at epigenomic level, regarding histone protein. The regulation of gene expression depends on accessibility of the DNA double helix, based on a hierarchy of folding events in which demethylases play a crucial role. JHDM1D (Jumonji Histone DeMethylase 1D) is an histone demethylase that belongs to the Jmjc protein family, capable of demethylating specifically lysine 9 and lysine27 di/monomethylate of histone H3. Some works show the relationship between this enzyme and the neural differentiation in the chick, in the zebrafish and in mouse embryonic stem cell and there is evidence of its involvement in some mammalian diseases. Nobody has studied the role of JHDM1D in retinal development even if it seems an intriguing field of research. This experimental thesis shows the direct involvement of JHDM1D in the developing retina, promoting the differentiation of retinal progenitors into photoreceptors. This is demonstrated by the microinjection of the mRNA of JHDM1D at 16-cell stage embyo of Xenopus laevis, together with GFP as a tracer of injection, into the blastomere D1.2.
On the contrary, microinjection of different doses of JHDM1D at 4-cell stage does not appear to significantly affect the expression of Rx1, CycD1 and Ntubulin as assayed by whole-mount in situ hybridization at neurula stage. Altogether, these data indicate a role for JHDM1D during retinogenesis and represent a starting point to address the epigenetic control of retina development in the Xenopus laevis model system.