• Farmcogenetica
• combinazioni farmacologiche
• tumore della vescica

Introduzione. In questa tesi sono stati condotti studi sperimentali per chiarire il ruolo dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed nell'effetto citotossico di tali chemioterapici, e per caratterizzarne il profilo farmacogenetico in linee cellulari e tessuti di carcinoma a cellule transizionali della vescica.
La gemcitabina (2',2'-difluoro-2'-deossicitidina, dFdC) è un profarmaco idrofilo e, per esercitare la sua azione citotossica, deve essere trasportato attraverso la membrana plasmatica da specifici carriers e successivamente fosforilato, dapprima, nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina monofosfato (dFdCMP), poi nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina difosfato (dFdCDP), e infine nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina trifosfato (dFdCTP), che compete con la deossicitidina trifosfato (dCTP) per l'incorporazione nel DNA e inibisce la DNA polimerasi. L'ingresso nella cellula avviene principalmente per mezzo del trasportatore nucleosidico equilibrativo 1 (hENT1); la prima fosforilazione, essenziale per l'attivazione della gemcitabina, è catalizzata dall'enzima deossicitidina chinasi (dCK), mentre la 5’-nucleotidasi (5’-NT) e la citidina deaminasi (CDA) sono responsabili delle reazioni del catabolismo.
Il pemetrexed è un composto di recente scoperta, appartenente alla categoria dei nuovi farmaci antifolati. Il suo meccanismo d’azione coinvolge sia la sintesi de novo delle purine sia quella del timidilato, mediante l’inibizione di tre enzimi folato-dipendenti: timidilato sintetasi (TS), diidrofolato reduttasi (DHFR) e glicinamide ribonucleotide formiltransferasi (GARFT). Molti studi hanno inoltre dimostrato il ruolo del pemetrexed nella modulazione del ciclo cellulare e nelle modificazioni dei pools di nucleotidi, che potrebbero influenzare l’attività di diversi chemioterapici somministrati in associazione.
I motivi che permettono di ipotizzare un vantaggio terapeutico nell’uso combinato di tali farmaci sono i seguenti: 1) la sincronizzazione della popolazione cellulare in fase S, determinata dall’esposizione al pemetrexed, potrebbe aumentare l’incorporazione della gemcitabina nel DNA; 2) la modulazione della fosforilazione della proteina Akt, coinvolta nella mediazione di stimoli anti-apoptotici, in seguito al trattamento con pemetrexed, potrebbe favorire l’induzione di morte cellulare programmata da parte della gemcitabina; 3) l’inibizione della sintesi de novo delle purine causata dal pemetrexed potrebbe determinare un incremento dell’espressione genica e dell’attività dei sistemi di trasporto dei nucleosidi e degli enzimi della sintesi di salvataggio, fra cui la dCK.
Materiali e metodi. Gli studi in vitro sono stati condotti su due linee cellulari di carcinoma a cellule transizionali della vescica T24 e J82. Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di gemcitabina e pemetrexed (0,3 nM -33 μM) singolarmente e in associazione, per tempi di esposizione rispettivamente di 1 e 24 ore, seguiti da ulteriori 24 ore di coltivazione in assenza di farmaco. L’effetto citotossico è stato valutato mediante il calcolo della concentrazione inibente il 50% della crescita cellulare (IC50) e l'interazione farmacologica è stata studiata con l’indice di combinazione (CI). Per valutare eventuali modulazioni del ciclo cellulare indotte dai farmaci in esame è stato condotto uno studio citofluorimetrico che ha permesso di ottenere un’analisi quantitativa del DNA mediante colorazione con una soluzione di ioduro di propidio 25 microg/ml. La valutazione dell’induzione di apoptosi da parte dei due chemioterapici, a concentrazioni pari all’IC50, è stata effettuata sia con l’analisi immunoenzimatica dell’inattivazione della proteina anti-apoptotica Akt sia con l’osservazione delle tipiche anomalie morfologiche mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando come marcatore del DNA nucleare la bisbenzimide. Inoltre, l’eventuale modulazione dell’espressione genica degli enzimi coinvolti nel meccanismo d’azione della gemcitabina e del pemetrexed, in cellule esposte ai due farmaci a concentrazioni pari all’IC50, è stata valutata per mezzo della PCR quantitativa, utilizzando sonde e primers specifici.
Gli studi ex vivo sono stati condotti su 12 campioni di tessuto tumorale di vescica, per mezzo della metodica di PCR quantitativa, è stata analizzata l’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione dei chemioterapici in esame.
Risultati. La gemcitabina e il pemetrexed hanno determinato un’inibizione di tipo dose-dipendente della proliferazione cellulare, con valori di IC50 rispettivamente di 91,7±5,1 e 64.9±5,3 nM nelle cellule T24, e 4336,7±833,3 e 2566,9±339,4 nM nelle cellule J82. I due farmaci in associazione hanno mostrato il più spiccato effetto sinergico citotossico (CI<1) quando impiegati nella sequenza in cui il pemetrexed precede la gemcitabina nelle cellule T24, mentre nelle cellule J82 l’effetto citotossico delle due combinazioni non ha dimostrato differenze statisticamente significative. L’analisi del ciclo cellulare ha dimostrato che l’esposizione al pemetrexed determina un incremento della percentuale di cellule in fase S da 27,16 a 39,28% nelle T24 e da 39,46 a 51,34% nelle J82; risultati simili sono stati ottenuti nella linea T24 inseguito all’esposizione con gemcitabina. Inoltre il trattamento con pemetrexed e gemcitabina ha causato la riduzione della quantità di Akt fosforilata; in particolare, per il pemetrexed sono state registrate maggiori percentuali di inibizione, pari rispettivamente a -75,0% e -73,2% nelle cellule T24 e J82. L’associazione dei due farmaci ha prodotto un aumento statisticamente significativo (P<0,05) dell’indice apoptotico in tutte le linee cellulari in studio. Infine, l’analisi con PCR quantitativa ha permesso di valutare le modulazione dei livelli di espressione dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione della gemcitabina (dCK e hENT1) e del pemetrexed (TS e GARFT), dimostratando che l’esposizione al pemetrexed induce un incremento statisticamente significativo dell’espressione genica di dCK e hENT1, nelle due linee cellulari, e di TS e GARFT nelle cellule esposte alla gemcitabina. Utilizzando la stessa metodica è stata anche valutata l’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione di gemcitabina nei 12 campioni tissutali, dimostrando una correlazione statisticamente significativa dell’espressione genica di dCK e di hENT1 con la risposta clinica in pazienti trattati con gemcitabina.
Conclusioni. I risultati del presente studio permettono di affermare che l’associazione tra pemetrexed e gemcitabina ha un’elevata attività antitumorale nelle linee cellulari di carcinoma a cellule transizionali della vescica, risultante da interazioni favorevoli a livello della modulazione del ciclo cellulare, dell’induzione di apoptosi e dell’influenza sull’espressione di geni coinvolti nel meccanismo d’azione dei farmaci. Questi dati rappresentano pertanto la base scientifica per lo sviluppo razionale di tale combinazione nell’ambito di un trattamento chemioterapico ottimizzato sul profilo genetico della neoplasia.