• enzima DNMT 3a
• infarto miocardico
• microRNA
• Rattus norvegicus
• real time
• western blot

I microRNA sono una classe di molecole di RNA a singolo filamento, lunghe 19-25 nucleotidi, generati a partire da trascritti non codificanti aventi struttura ad hairpin. Essi funzionano come molecole guida nel silenziamento genico post-trascrizionale: appaiandosi con la regione 3’-UTR degli mRNA target possono condurre alla diretta degradazione dei messaggeri oppure alla repressione della loro traduzione.
Dati recenti hanno dimostrato che, a seguito di patologie coronariche, anche l’espressione di molti microRNA subisce profonde alterazioni. Il mio progetto di tesi ha come scopo quello di andare ad analizzare l’espressione di alcuni componenti delle famiglie dei miR-29 e miR-30 in tessuti cardiaci di ratti sottoposti ad ischemia-riperfusione oppure ad infarto a seguito dell’intervento di chiusura momentanea o permanente dell’arteria coronaria. Entrambe queste famiglie di miRNA, infatti, sembrano essere coinvolte nel processo fibrotico che si verifica in risposta a stress da ipossia. Inoltre, analisi in silico e studi effettuati su tessuti tumorali suggeriscono che entrambi i miRNA oggetti del nostro studio hanno anche tra i loro target le de novo Methyltransferase 3a e 3b ( DNMT 3a e DNMT 3b ), che sono due enzimi chiave nel processo epigenetico della metilazione del Dna. La seconda parte della mia tesi ha quindi lo scopo di analizzare l’espressione dell’enzima DNMT 3a negli stessi tessuti ischemici con l’obiettivo di capire se la riprogrammazione dell’espressione genica che si verifica in un cuore post-ischemico possa almeno in parte essere causata da modificazioni epigenetiche come quelle che l’alterazione della DNMT3a potrebbe comportare.
Per misurare le variazioni del livello di espressione dei miRNA mi sono avvalsa dell’utilizzo di tecniche di biologia molecolare quali: estrazione dell’RNA totale dai tessuti, retrotrascrizione specifica per miRNA, Real Time PCR. Grazie all’utilizzo di strumenti informatici mi è stato possibile misurare le variazioni relative di espressione dei miRNA in analisi nei diversi campioni, rispetto al controllo, normalizzate rispetto ad uno standard interno housekeeping ( ho utilizzato lo small nuclear RNA U1 ). Per quantizzare la DNMT3a, sono state estratte le proteine totale dai tessuti, effettuati esperimenti di Western blot e, mediante un’analisi densitometrica le bande ottenute sono state normalizzate rispetto ad una proteina costitutivamente espressa, la GAPDH.
I campioni sui quali ho lavorato sono stati prelevati da ratti adulti sottoposti a tre diversi tipi di interventi chirurgici:
• Ratti di controllo, detti Sham, ovvero animali che hanno subito taglio chirurgico ed apposizione, senza legatura, di un laccio intorno all’arteria coronaria
• Ratti riperfusi, detti Ref, ovvero animali che hanno subito una legatura transitoria di 30’ dell’arteria coronaria; essi rappresentano un modello artificiale di ischemia-riperfusione
• Ratti infartuati, detti Lad, ovvero animali che hanno subito una legatura permanente dell’arteria coronaria; essi rappresentano un modello artificiale di infarto
Da ogni animale sono stati prelevati tessuti cardiaci da diverse posizioni: degli Sham e dei Ref sono stati analizzati tessuti provenienti dalla zona border, BZ, e remota, RZ, rispetto al punto di apposizione/legatura del filo, mentre dei Lad sono stati analizzati tessuti provenienti anche dalla zona infartuata, IZ.
I dati ottenuti evidenziano una down-regolation sia del miR 29c sia del miR 30e nei tessuti provenienti dalle zone IZ e BZ prelevati da animali Lad soppressi dopo 3 e 14 giorni dall’intervento. Inoltre viene evidenziata una up-regolation dell’enzima DNMT 3a in particolar modo nei tessuti provenienti dalla zona IZ prelevati da animali Lad soppressi dopo tre giorni dall’intervento. Mettendo a confronto le variazioni dei livelli dei miRNA analizzati con quelle dei livelli della DNMT 3a ( 120 KDa ) è stato possibile vedere come esista tra questi una discreta correlazione inversa che supporta l’ipotesi che nei tessuti post-ischemici tali miRNA controllino negativamente l’espressione della DNMT 3a.