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L’ingegneria tissutale è un campo interdisciplinare innovativo che applica i principi delle scienze ingegneristiche a quelli delle scienze della vita per lo sviluppo di sostituti biologici che consentano di migliorare, riparare o curare tessuti biologici e/o interi organi. La strategia di base consiste nell’impiego di cellule viventi in combinazione con strutture tridimensionali (scaffolds) biocompatibili e biodegradabili, in grado di sviluppare sostituti tissutali bioattivi al fine di promuovere la rigenerazione in situ dei tessuti. Il presente lavoro di tesi è stato incentrato sulla caratterizzazione fisico chimica e biologica di scaffolds inorganici bioceramici e scaffolds fibrosi organici di natura polimerica impiegati rispettivamente come supporti tridimensionali nella rigenerazione di tessuto osseo e come sostituti della matrice extracellulare nell’ambito del processo di guarigione delle ferite e rigenerazione del tessuto epiteliale.
Gli scaffolds compositi bioceramici a base di vetri bioattivi (BG9_Ca e 45S5 bioglass®) e idrossiapatite (HA) sono forniti dal Dipartimento di Ingegneria dei Materiali e Ambientale dell’Università di Modena e Reggio Emilia, nell’ambito di una collaborazione volta alla loro caratterizzazione biologica come potenziali candidati nell’ingegneria tissutale dell’osso. Questi supporti sono caratterizzati da una superficie esterna che presenta un’elevata porosità, tale da mimare la morfologia del tessuto osseo offrendo sia un adeguato supporto meccanico sia un’elevata permeabilità ai fluidi corporei e ai nutrienti. Le indagini biologiche sono state condotte al fine di valutare la loro capacità di sostenere la vitalità, l’adesione, la proliferazione cellulare e la bioattività. I campioni sono stati inizialmente trattati con una soluzione tampone a pH 7.4 (SBF) in grado di simulare i fluidi corporei (Kokubo 1990). Tale trattamento ha avuto lo scopo di neutralizzare il pH degli scaffolds bioceramici, mediante un processo di scambio ionico tra la superficie dei compositi ed il fluido circostante, favorendo la deposizione sulla superficie del biovetro di aggregati di idrossiapatite, il principale costituente minerale del tessuto osseo in grado di stimolare il processo di osteogenesi. Gli studi sono stati condotti impiegando come modello cellulare la linea di pre-osteoblasti embrionali murini MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593), una linea clonale che deriva dal cranio di topi neonati, e che, in opportune condizioni di crescita, differenzia verso un fenotipo osteoblastico, formando in vitro tessuto osseo mineralizzato. Le cellule, seminate sugli scaffolds, sono state opportunamente stimolate verso il differenziamento osteoblastico mediante la somministrazione di acido ascorbico e β-glicerolfosfato (Wang 2010). I parametri di vitalità e proliferazione cellulare sono stati determinati mediante l’utilizzo del saggio dell’alamar-Blue®; la morfologia cellulare e la modalità di colonizzazione dei supporti bioceramici sono state evidenziate con analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM). Il differenziamento cellulare è stato analizzato mediante il dosaggio dell’isoforma ossea della fosfatasi alcalina (ALP), un enzima di membrana glicosilato che catalizza l’idrolisi dei fosfati inorganici ed è considerato un marcatore precoce di espressione del fenotipo osteoblastico (Beck 1998). I campioni compositi bioceramici si sono rivelati in grado di supportare l’adesione e la proliferazione delle cellule pre-osteoblastiche MC3T3-E1 sostenendo il differenziamento verso un fenotipo osteoblastico. Pertanto tali materiali sono da considerarsi promettenti per le applicazioni di ingegneria tissutale dell’osso.
Gli scaffolds polimerici fibrosi sono stati preparati mediante la tecnica innovativa del melt electrospinning presso il laboratorio dove è stato condotto il presente lavoro di tesi. Brevemente, questa tecnica sfrutta la differenza di potenziale generata tra l’ago di una siringa caricata con il polimero fuso ed un collettore per l’estrusione delle fibre (Detta 2010). Il polimero scelto per la preparazione dei supporti è un poliestere biocompatibile e biodegradabile con struttura macromolecolare a stella e con un peso molecolare (PM) di 189000 g/L denominato poli(ε-caprolattone) (*PCL189). L’analisi SEM degli scaffolds prodotti ha evidenziato fibre tridimensionali disposte in modo random, con un diametro medio di circa 50 µm, spazi interfibra di circa 20-250 µm e una buona porosità superficiale. Gli scaffolds sono stati sottoposti ad indagini preliminari per verificarne la capacità di supportare la crescita cellulare e sostituire in modo adeguato la matrice extracellulare naturale, funzionando da impalcatura di sostegno per la rigenerazione del tessuto cutaneo. A tale scopo sono state selezionate le linee cellulari di fibroblasti embrionali murini balb/3T3 clone A31 (ATCC CCL-163) e cheratinociti umani, HaCaT (Cell Lines Service 300493) coltivate sui supporti polimerici sia in mono-coltura che in co-coltura. Le valutazioni sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare sono state condotte mediante il saggio colorimetrico del WST-1. Per valutare la morfologia cellulare e la modalità di colonizzazione degli scaffolds polimerici sono state impiegate le tecniche di microscopia confocale a scansione (CLSM), di microscopia SEM e il saggio dell`immunofluorescenza indiretta per la visualizzazione delle citocheratine umane. Inoltre, è stato condotto uno studio volto a quantificare la produzione di collagene di tipo I da parte dei fibroblasti coltivati sugli scaffolds polimerici, mediante l’impiego del colorante Direct Red 80 (Junqueira 1979). I risultati hanno evidenziato la capacità degli scaffolds a base di *PCL189 di favorire la produzione di collagene da parte dei fibroblasti, di supportare la crescita, l’adesione e l`organizzazione spaziale di entrambe le linee cellulari in modo analogo al tessuto epitelale. Grazie ai promettenti risultati ottenuti, gli scaffolds polimerici di natura organica a base di *PCL189, suggeriscono la possibilità di impiegare questi sistemi nella rigenerazione del tessuto cutaneo.