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Tesi etd-03302012-001529


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
CAPRIOLI, ENRICA
URN
etd-03302012-001529
Title
Valutazione dell’azione catalitica dell’imidazolo nell’idrolisi dell’Ach e del ruolo del mediatore colinergico nella proliferazione di cellule di melanoma cutaneo in coltura.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
18/04/2012;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
18/04/2052
Riassunto analitico
<br>Introduzione. L’organocatalisi è la capacità catalitica di piccole molecole organiche che, sebbene sia conosciuta da più di un secolo, solo nell’ultimo decennio ha avuto un’ attenzione importante da parte del mondo scientifico, che ha visto in questa giovane scienza grosse potenzialità nella chimica organica sintetica,soprattutto nel ramo della sintesi enantioselettiva, visto che a differenza dei catalizzatori tradizionali a base di metalli di transizione, la maggior parte degli organo-catalizzatori sono stabili all’aria e all’acqua,facilmente maneggiabili nella sperimentazione, relativamente non tossici e facilmente ottenibili in forma pura. In questo contesto, l’organocatalisi si propone quindi<br>non solo come un metodo vantaggioso per la semplicità, la sicurezza e l’ economicità, ma<br>soprattutto come strategia per ottenere in ambito terapeutico farmaci con singoli centri<br>enantiomerici e con livelli sempre più elevati di complessità per raggiungere maggiore potenza e selettività, sicuramente più difficili da ottenere con le vie sintetiche tradizionali.<br>Tra gli organocatalizzatori, l’imidazolo ed analoghi strutturali sono dotati di attività esterasica. In letteratura sono riportati, infatti, dati riguardo le diverse attività catalitiche nei confronti di esteri tra cui fenilacetati, Nacetilserinamide e p-nitrofenolo e l’aminolisi di tioesteri peptidici. Per quanto riguarda l’acetilcolina un lavoro del 1973 la capacità dell’imidazolo di catalizzare la sintesi di questo mediatore. Ad oggi non ci sono evidenze sulla capacità catalitica nei confronti dell’idrolisi del mediatore stesso.<br>Una seconda parte di questa tesi è stato il ruolo dell’acetilcolina non neuronale nella crescita di cellule tumorali. La presenza di un sistema colinergico non neuronale è stata ampiamente riconosciuta e molti sono gli studi che dimostrano che che tutti i componenti del sistema colinergico, neurotrasmettitore, recettori, enzimi e proteine di reuptake sono presenti anche a livello non neuronale. Filogeneticamente questo sistema appare addirittura essere il più antico,visto che si trova anche nei batteri e nelle piante. Oltre a importanti ruoli fisiologici in diversi tessuti, l’acetilcolina non neuronale sembra implicata anche nello sviluppo di tumori, ad esempio studi compiuti su cellule di carcinoma di colon e del polmone hanno suggerito che questa molecola possa agire da fattore di crescita.<br><br>Scopo: come indicato nel’Introduzione, l’attività organocatalitica dell’imidazolo è già stata<br>descritta da vari Autori. Tuttavia, fino ad oggi, nessun lavoro pubblicato in letteratura riporta un’attività simil-colinesterasica di questo composto. Partendo dall’evidenza di un’ attività di questo tipo descritta, invece, recentemente in un precedente lavoro di tesi condotto nel laboratorio di Farmacologia molecolare del Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie, (Giambertone A. 2011), in questo lavoro di tesi è stata meglio caratterizzata tale capacità dell’imidazolo.<br>Nella seconda parte di questo lavoro di tesi si è studiato il ruolo dell’Ach non neuronale sulla crescita di cellule tumorali di melanoma cutaneo A375. Sebbene siano stati riportati effetti pro proliferativi del mediatore colinergico e di molecole colino-mimetiche su diverse linee cellulari tumorali, non ci sono ad oggi evidenze che confermino o escludano una tale azione nel melanoma.<br>L’interesse verso questo tipo di tumore è dettato anche dall’effetto sulla proliferazione e sul differenziamento che l’ACh esercita a livello di cheratinociti e dalla presenza di un sistema non neuronale descritto nei melanociti.<br><br>Materiali e metodi: per determinare l’attività catalitica dell’imidazolo, sono stati eseguiti Saggi di Ellman sia con la molecola stessa che con pirrolo e metilimidazolo, al fine di chiarire le caratteristiche strutturali che determinano la reattività della molecola, usando come substrato non solo l’acetiltiocolina, ma anche gli analoghi propioniltiocolina e butirriltiocolina.<br>Per verificare l’attività colinesterasica dell’imidazolo in un saggio che non prevedesse l’uso di del tioestere della colina, come è, invece, nel saggio di Ellman, è stato realizzato anche un secondo saggio, Amplex Red Acetylcholine/acetylcholinesterase (Roche).<br>Per la seconda parte della tesi è stata cercata la messa a punto di un protocollo di crescita per le cellule tumorali A375 in presenza di acetilcolina basandosi su studi analoghi trovati in letteratura.<br>Per capire se e come questa molecola agisca sulla crescita delle cellule A375 sono stati saggiati anche agonisti ed antagonisti colinergici, quali la nicotina e il betanecolo, l’atropina, la tubocurarina e l’esametonio, in modo da individuare la via recettoriale coinvolta nella trasmissione del segnale.<br>Sono stati condotti esperimenti a 48, 72 e 120 ore con cellule di melanoma A375 fatte crescere in presenza di mezzo di solo DMEM e per testare la vitalità cellulare è stato impiegato il WST-1 ed è stata eseguita la lettura a 450nm dopo un’ora di incubazione.<br><br>Risultati e conclusioni: i risultati ottenuti nel presente lavoro di tesi, non sembrano indicare un ruolo significativo dell’aceticolina endogena ed esogena nella crescita delle cellule tumorali A375 coltivate nelle normali condizioni di crescita, non è stato, infatti, rilevato un aumento della vitalità/proliferazione cellulare. <br>Per verificare se l’assenza di specificità dell’ACh nei confronti di recettori N e M potesse<br>mascherare un effetto colinergico sulla proliferazione/vitalità, sono stati testati gli agonisti selettivi betanecolo (muscarinico) e nicotina (nicotinico). <br>Inoltre, per verificare l’eventuale azione di Ach prodotta dalle cellule come abbiamo testato anche i seguenti antagonisti:atropina, tubocurarina e esametonio, ma soltanto l’esperimento condotto con l’atropina denota un comportamento interessante, anche se altalenante, con un brusco abbattimento alla concentrazione di 10-9M.<br>Al momento questa tesi rappresenta il primo lavoro in cui si studiano gli effetti del sistema<br>colinergico non neuronale nella crescita delle cellule di melanoma.<br>Sono necessari, tuttavia, ulteriori indagini, al fine di chiarire l’espressione di questo sistema in questa linea cellulare e le azioni da esso compiute.<br>Valutazioni successive verranno eseguite in seguito per verificare il ruolo dell’acetilcolina come fattore di crescita in queste condizioni.<br>Per quanto riguarda il secondo aspetto affrontato in questo lavoro di tesi, i saggi di Ellman compiuti con imidazolo, pirrolo e metilimidazolo, dimostrano che la presenza dei due N è essenziale per l’azione catalitica della molecola.<br>L’attività tioesterasica dell’imidazolo è stata ampiamente confermata ed è stata attribuita al potere nucleofilo della molecola, come confermato dalla maggiore reattività del metilimidazolo e dall’inattività del pirrolo.<br>Anche esperimenti condotti con substrati differenti dall’acetiltiocolina, quali propioniltiocolina ebutirriltiocolina, confermano l’attività tioesterasica. <br>Devono, invece, essere individuati altri metodi per ricercare l’attività colinesterasica della<br>molecola,vista l’impossibilità di usare il saggio Amplex.<br>
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