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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-03292013-112637


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
LODOVICHI, SAMUELE
Indirizzo email
87samuele@alice.it
URN
etd-03292013-112637
Titolo
Influenza dei pathway coinvolti nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA nell'instabilita' genomica indotta da BRCA1 in Saccharomyces cerevisiae
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Relatori
relatore Prof. Galli, Alvaro
Parole chiave
  • ricombinazione intracromosomica
  • reversione genica
  • RAD51
  • RAD50
  • MSH6
  • pathways riparazione DNA
  • MRE11
  • Saccharomyces cerevisiae
  • instabilità genomica
  • brca1
Data inizio appello
29/04/2013
Consultabilità
Completa
Riassunto
Nell’uomo, il gene BRCA1 codifica per una proteina facente parte di un complesso multiproteico implicato nella riparazione del DNA.
Tali pathway di riparazione si ritrovano nell'organismo modello Saccharomyces cerevisae e questo rende il lievito un ottimo candidato per questo tipo di studi. Poichè, il lievito non ha l'omologo umano di BRCA1, l'espressione viene mediata attraverso un vettore plasmidico tramite crescita in terreno contenente l’induttore specifico che in questo caso è il galattosio.
Studi precedenti effettuati dal gruppo dove ho svolto la tesi, hanno dimostrato che, in lievito, l'espressione di varianti missenso di BRCA1 associate a tumore causano un aumento della ricombinazione e che l’espressione di BRCA1 wild type determina un difetto nella crescita. Lo scopo di questo studio è di determinare se questi pathway specifici di riparazione possano influenzare la ricombinazione e mutazione genica e che quindi potrebbero avere un ruolo nella tumorigenesi dovuta a BRCA1. In particolare, i geni omologhi a quelli di lievito che influenzano il fenotipo indotto dalle varianti BRCA1, potrebbero avere un ruolo nella tumorigenesi come “modificatori” del rischio in pazienti che portano queste varianti.
I ceppi aploidi di Saccharomyces cerevisiae difettivi per i suddetti pathway di riparazione presi in esame sono: RSY6rad51Δ difettivo nella riparazione per ricombinazione omologa, RSY6rad50Δ e RSY6mre11Δ difettivi nella riparazione per ricombinazione omologa e non. Poiché è noto che il mismatch repair influenza la ricombinazione in lievito, abbiamo costruito per gene targeting un nuovo ceppo difettivo per il mismatch repair chiamato RSY6msh6Δ per poter determinare anche l’effetto di questo gene sul fenotipo indotto da BRCA1. Questi ceppi sono stati trasformati con plasmidi contenenti BRCA1 wt o le varianti BRCA1 scelte secondo la loro classificazione. Prima di determinare l’effetto di BRCA1 in questi ceppi, abbiamo determinato il livello della proteina BRCA1 wild type o mutata in tutti i ceppi utilizzati. I risultati di Western blot mostrano che sia la proteina wt che le varianti scelte vengono espresse in tutti ceppi di lievito. Questo risultato è considerato molto importante, quando si vuole validare un saggio funzionale.
Poiché i ceppi derivati da RSY6 contengono un sistema di ricombinazione intracromosomica che permette di misurare la frequenza di tale evento direttamente in piastra, abbiamo determinato se l’espressione di BRCA1 wt e delle varianti influenzasse la ricombinazione. Dai risultati ottenuti sembra che questi pathway non influiscano in modo significativo nel processo di ricombinazione genica nel ceppo aploide, eccetto che nel ceppo RSY6rad50Δ dove l’espressione di alcune varianti diminuisce della frequenza di ricombinazione. Al contrario, in tutti i ceppi studiati alcune varianti sembrano determinare un aumento della mutazione. In particolare, nel ceppo RSY6rad50Δ dove tutte le varianti inducono un forte aumento della frequenza di mutazione indicando che questo pathway ha una forte relazione con BRCA1 e quindi può essere un forte modficatore del rischio in pazienti che portano mutazione sul gene BRCA1.
L’espressione di BRCA1 wt inibisce la crescita in lievito. Poiché, il ruolo dei pathway della riparazione del DNA su questo fenotipo non è completamente chiaro, abbiamo determinato se l’effetto sulla crescita determinato dall’espressione di varianti BRCA1 associate a tumore possa essere in qualche modo modulato da questi pathway che, come ampiamente riportato, influenzano la sopravvivenza e la crescita cellulare. I dati ottenuti mostrano chiaramente che le diverse varianti inducono diversi livelli di inibizione della crescita nei vari ceppi deleti, indicando quindi che questi pathway modulano l'effetto inibitorio indotto da BRCA1.
Ancora una volta, si dimostra con questa tesi che il lievito Saccharomyces cerevisiae può essere un sistema genetico importante per determinare quali interazioni sono rilevanti per la tumorigenesi dovuta a mutazioni del gene BRCA1.
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