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• Ribozima hammerhead

I ribozimi sono piccole molecole di RNA a singolo filamento in grado di catalizzare la scissione dei legami fosfodiesterici presenti sulla propria o sulle altre molecole-bersaglio a RNA. La maggior parte dei ribozimi naturali conosciuti è di tipo self-processing; al contrario, quelli artificiali che si ottengono dall’applicazione di sofisticate tecniche di ingegneria molecolare presentano un dominio di riconoscimento opportunamente progettato per eseguire delle catalisi in cis, ovvero sullo stesso filamento, o in trans, quindi su una differente molecola a RNA. Allo scopo di realizzare molecole dotate di migliori proprietà funzionali è possibile, in vitro, apportare delle modifiche alle strutture dei ribozimi. La progettazione di molecole più efficienti e il loro possibile utilizzo non solo a fini sperimentali e di ricerca, ma anche clinici, rappresenta quindi un’importante strategia per la creazione di strumenti diagnostici e terapeutici.
Nonostante gli studi pubblicati in letteratura abbiano evidenziato l’esistenza di molteplici forme di ribozimi, le tipologie più comuni di eventuale impiego terapeutico sono quelle recanti il motivo hammerhead (“a martello”) o hairpin (“a forcina”). In particolare i ribozimi hammerhead, che catalizzano reazioni di trans-cleavage, costituiscono uno dei mezzi principali di silenziamento selettivo dell’espressione genica essendo in grado di riconoscere, legare e infine tagliare specifiche sequenze di RNA. Questi ribozimi sono elementi chiave della strategia di knock-down genico, tecnica con la quale è possibile modulare l’attività di uno specifico gene interferendo con naturali processi biologici. Il significato terapeutico del knock-down genico risulta evidente se inserito nel contesto di una possibile applicazione in campo oncologico con la possibilità di inibire l’espressione di un determinato gene coinvolto direttamente o indirettamente nella patogenesi dei tumori.
Questo progetto di tesi, svolto presso il laboratorio di Proteomica e Tecnologie genomiche dell'Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, è stato condotto con l’obiettivo di valutare l’entità dell’attività catalitica di un ribozima hammerhead disegnato e sintetizzato per svolgere la sua azione enzimatica sull’RNA messaggero di PD-L1, una proteina di membrana espressa in diversi tipi di tumori come il tumore al polmone non a piccole cellule e il melanoma cutaneo maligno. Questa proteina è un elemento fondamentale che fa parte di specifici checkpoint immunitari la cui attivazione conferisce al tumore la capacità di evadere le difese immunologiche dell’organismo ospite. In seguito all’insorgenza di mutazioni geniche, oppure a causa di un’alterazione dei meccanismi di controllo dei processi infiammatori, si può avere una upregulation di PD-L1 che, legandosi al recettore PD-1 espresso sulla membrana dei linfociti T che s’infiltrano nel tumore, ne induce l’apoptosi, favorendo la progressione della malattia neoplastica e lo sviluppo di metastasi.
Nello specifico, in questa tesi sperimentale è stata valutata l’attività endoribonucleasica del ribozima hammerhead di tipo extended, che costituisce un’evoluzione strutturale del precedente minimal. Tale strategia si basa sui dati ottenuti da studi precedenti realizzati in questo laboratorio che, se pur svolti su un target molecolare differente, hanno dimostrato un incremento sostanziale della funzionalità enzimatica della forma extended rispetto alla struttura minimal.
L’attività è stata suddivisa in tre fasi principali:
i. disegno teorico del ribozima anti-PD-L1
ii. sintesi della molecola
iii. valutazione delle sue proprietà catalitiche in vitro.
Attraverso il sistema informatico d’ingegneria molecolare “ALADDIN” è stata progettata l’intera sequenza nucleotidica del ribozima minimal diretto contro l’m-RNA di PD-L1. Al fine di ottenere una molecola che sia cataliticamente efficiente non solo in vitro, ma anche in vivo, la struttura fornita dal software è stata modificata in corrispondenza dell’estremità 5’e dello stem-loop II. Questo infatti è stato sostituito con lo stem-loop modificato del viroide del mosaico latente del pesco (peach latent mosaic viroid, PLMV, Saksmerprome et al.,2004), poichè analisi sperimentali precedenti hanno dimostrato che la presenza di questa sequenza, derivante dal ribozima naturale di PLMV, aumenta l’efficienza di taglio a concentrazioni sub-millimolari di magnesio, analogamente all’ambiente intracellulare. L’estremità 5’ invece è stata modificata aggiungendo la tripletta UAA che favorisce la strutturazione della molecola nella conformazione cataliticamente attiva. In questo modo è stato disegnato il ribozima hammerhead extended anti-PD-L1, oggetto di studio di questo lavoro di tesi.
Prima di procedere con la sintesi del ribozima è stata valutata l’esistenza di eventuali effetti di mismatch, cioè dei suoi possibili appaiamenti con altre molecole presenti nel trascrittoma umano che, pur avendo un ruolo biologico differente rispetto a PD-L1, presentano delle sequenze complementari che potrebbero essere riconosciute e tagliate dal ribozima. Questo aspetto non deve essere sottovalutato, specialmente nel caso di un’applicazione in vivo della molecola. Il ribozima, nell’organismo, potrebbe causare non solo una riduzione dell’espressione della proteina d’interesse, ma anche quella di altre molecole che presentano rispetto al target un elevato grado di omologia, con conseguente alterazione più o meno rilevante dei processi fisiologici in cui queste risultano coinvolte. Pertanto, la presenza nel trascrittoma della specie studiata di sequenze aventi un certo grado di omologia con i siti di appaiamento del ribozima sulla molecola target può rappresentare un fattore limitante per quanto riguarda la sua possibile applicazione. In previsione di una futura sperimentazione in vivo del ribozima anti-PD-L1 sarà quindi importante approfondire tale aspetto e ottimizzare la struttura del ribozima affinché agisca in modo selettivo solo sul target di interesse.
La sintesi di un ribozima può essere effettuata sfruttando due procedure differenti: quella chimica e quella enzimatica. Per tale ragione in questo progetto la sequenza catalitica è stata realizzata sia per via chimica, mediante l’uso di un sintetizzatore di oligonucleotidi che svolge ciclicamente e in modo automatico le diverse fasi del processo di sintesi (basandosi sulla chimica delle fosforoammiditi), sia per via enzimatica tramite la Taq DNA Polimerasi e la T7 RNA Polimerasi che agisce su un template di DNA. La stessa strategia è stata impiegata per la sintesi del target PD-L1.
Al termine della fase di sintesi le molecole ottenute con lo strumento DNA-Synthesizer sono state rimosse dalla fase solida e opportunamente trattate per rimuovere i gruppi funzionali protettori e le impurità derivanti dal distacco di parti della colonnina di vetro.
Le molecole a DNA del T7 Promoter, del template per il ribozima e del template per il target sono state analizzate mediante HPLC e, non richiedendo successive procedure di purificazione, sono state quantificate al nanodrop, ripartite in soluzioni a concentrazione nota e liofilizzate. I prodotti ottenuti dalla reazione con la T7 Polimerasi sono stati visualizzati con elettroforesi sul gel di agarosio e quantificati in HPLC.
Le molecole a RNA del ribozima e del target sono state purificate prima mediante HPLC e, successivamente, con cromatografia ad esclusione molecolare, ripartite in soluzioni a concentrazione nota e liofilizzate.
L’attività catalitica dei ribozima hammerhead extended anti-PD-L1 è stata analizzata in vitro misurando la cinetica della reazione di scissione della molecola bersaglio. Durante la sperimentazione sono state modificate, all’interno della soluzione di reazione, le concentrazioni di ribozima, del target e degli ioni magnesio, quest’ultimo fondamentale per consentire alla molecola del ribozima di assumere una conformazione spaziale tale da svolgere una catalisi ottimale sul substrato. La quantificazione dell’efficienza di taglio del ribozima è stata esaminata in HPLC. In particolare, in previsione di una valutazione dell’attività del ribozima in sistemi biologici, sono state impiegate concentrazioni sub-millimolari di magnesio in modo da rendere l’ambiente di reazione il più simile possibile a quello intracellulare.
I risultati ottenuti sono stati positivi ed hanno consentito il conseguimento dell’obiettivo prefissato, ovvero la produzione di un ribozima hammerhead capace di svolgere efficientemente la catalisi della molecola bersaglio anche a basse concentrazioni di ioni magnesio.