• dinamica
• Imaging a singola molecola
• neurotrofina
• TrkA

Questo lavoro di tesi si inserisce in una linea di ricerca che si propone di studiare la dinamica a singola molecola di recettori di membrana responsivi a fattori di crescita neuronale (neurotrofine, NT), ed a correlarla alla loro attività di trasduzione del segnale. Lo studio condotto precedentemente era relativo al recettore ad attività tirosin-chinasica TrkA, caratterizzato da un’alta affinità di legame per il capostipite delle NT, l’NGF. A questo recettore è stata geneticamente fusa la sequenza del tag acyl carrier protein (ACP), tecnologia sfruttata per ottenere la marcatura del recettore situato sulla superficie di cellule vive. Studi basati su tracking di singole particelle (SPT-single particle tracking) in membrana hanno evidenziato che il recettore TrkA wild type (wt), in assenza di ligando, mostra un moto di tipo per lo più diffusivo caratterizzato da un coefficiente di diffusività di circa 0,5µm2/s; in presenza del ligando NGF la dinamica invece rallenta, aumenta il numero di traiettorie confinate e il numero di forme dimeriche e oligomeriche del recettore, che verosimilmente sono responsabili delle piattaforme di signalling e di internalizzazione del recettore attivato. Nel contesto di esperimenti miranti a comprendere il collegamento fra il tipo di moto in membrana e le diverse risposte biologiche, è stato costruito un mutante privo di attività chinasica (dead-kinase), ottenuto attraverso la mutazione K547N, la quale va a bloccare il sito di legame per l’ATP a livello del dominio chinasico. Tale mutante non è in grado di indurre i processi di autofosforilazione del recettore stesso e di attivazione di effettori intracellulari in risposta al ligando NGF. Nell’ambito degli studi sulla mobilità il suo andamento è risultato essere rallentato indipendentemente dalla presenza di NGF, un comportamento paradossalmente simile a quello riportato per il recettore wt attivato da NGF.
Il lavoro di tesi parte da questa osservazione, con lo scopo di comprendere la causa del comportamento dinamico del mutante dead-kinase; la nostra ipotesi è che esso venga bloccato in precursori di vescicole di internalizzazione per la degradazione, ma non è nota quale sia la funzionalità compromessa che porta a questa condizione. Abbiamo scelto di indurre mutazioni puntiformi a livello di singole tirosine del dominio citoplasmatico del recettore con l’obiettivo di indagare se e quali residui mutati siano responsabili del comportamento dinamico del mutante dead-kinase. Sulla base della letteratura disponibile, le tirosine che sono state scelte per la mutagenesi sono le seguenti: Y499, Y679, Y683, Y704, Y684, Y760, Y794 (numerazione riferita al cDNA di ratto) e la mutazione su di esse indotta è stata una conversione a fenilalanina, che impedisce la fosforilazione del residuo pur mantenendone la struttura aromatica, senza quindi alterare la struttura della proteina. A partire dal costrutto ACP-TrkA wt, sono stati prodotti sia mutanti singoli per ciascuno dei suddetti residui che mutanti combinati, in cui i residui sono stati raggruppati in base alla specifica funzione che li vede coinvolti; nel dettaglio, verranno discussi i risultati sul Kinase-Mutant, mutante combinato dei residui Y679F-Y683F-Y684F, responsabili dell’attività chinasica e il Recruitment-Mutant, mutante combinato dei residui Y499F-Y760F-Y794F, responsabili del reclutamento di effettori intracellulari. Tali mutanti, insieme al costrutto wt e al dead-kinase, sono stati quindi trasfettati nella linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y. La validazione biochimica dei costrutti è stata effettuata usando due approcci sperimentali: i) saggi biochimici di Western Blot e di immunoprecipitazione; ii) localizzazione dei quattro costrutti espressi e marcati in membrana attraverso acquisizioni in microscopia confocale. Questi ulteriori esperimenti sono stati finalizzati a capire se i quattro costrutti vengono espressi correttamente dalle cellule o vanno piuttosto incontro a processi degradativi e se i loro livelli di espressione sulla membrana plasmatica, almeno in condizioni di assenza di NGF, sono paragonabili.
La presenza dell’ACP-tag ha permesso la biotinilazione selettiva dei recettori espressi sulla membrana delle cellule e la loro successiva marcatura con dei fluorofori molto brillanti (Quantum-dots) coniugati a streptavidina. È stato quindi possibile effettuare misure di SPT dei quattro costrutti marcati sulla membrana plasmatica di cellule vive, mediante microscopia TIRF. I filmati così ottenuti sono stati analizzati con un programma di tracking per la generazione delle traiettorie dei recettori, che poi ho processato utilizzando algoritmi di analisi già disponibili in laboratorio. I risultati ottenuti indicano un comportamento diffusivo del Kinase-Mutant simile a quello del dead-kinase mentre il Recruitment-Mutant ha un comportamento paragonabile a quello del TrkA wt. Ciò suggerisce che, verosimilmente, le tirosine coinvolte nel comportamento anomalo del mutante dead-kinase siano quelle responsabili dell’attività chinasica del recettore.