L’obiettivo a lungo termine del progetto di ricerca nel cui ambito si è sviluppata questa
Tesi, riguarda lo studio dei meccanismi grazie ai quali la proteina MICAL2 contribuisce
alla motilità orientata dall’ipossia delle cellule endoteliali (CE) durante l’angiogenesi.
MICAL2 è una proteina citosolica che modula lo stato redox dell’actina e fa parte di
un sistema di guida cellulare “orientata” che coinvolge le semaforine.
A differenza dei vasi di maggior calibro, la configurazione dei capillari non si basa su
istruzioni genetiche ma dipende da segnali locali. La concentrazione locale di ossigeno
rappresenta un segnale molto importante. La funzione di MICAL nell’endotelio è ancora
completamente sconosciuta. Più in generale poco è noto di come i fattori-chiave
dell’angiogenesi medino i cambiamenti del citoscheletro associati alla crescita dei
filopodi per permettere una migrazione orientata delle CE durante l’angiogenesi.
La nostra ipotesi è che MICAL grazie alla sua struttura, alla capacità di legare ossigeno,
al controllo sull’assetto del citoscheletro [dati di letteratura], e al fatto di essere
espressa in cellule endoteliali [nostri dati non pubblicati], possa modificare l’assetto
locale del citoscheletro delle CE in relazione alla concentrazione locale di ossigeno, e, in
questo modo dirigere la motilità orientata da ipossia delle CE durante l’angiogenesi.
La funzione di MICAL potrebbe essere deregolata nella neo-angiogenesi patologica.
Obiettivi
I principali obiettivi di questa Tesi sono due: 1) produrre e caratterizzare un anticorpo
policlonale specifico per MICAL2, per poter caratterizzare l’espressione di MICAL in
tessuti normali e patologici, 2) descrivere l’espressione di MICAL2 in un modello di
angiogenesi normale. A questo scopo è stata scelta la retina di topo perchè mostra una
vascolarizzazione completamente post-natale, che procede con il concomitante
restringimento di un anello ipossico che circonda l’albero vascolare in formazione.
Materiali e Metodi, Risultati
Con metodi bio-informatici abbiamo disegnato due peptidi basati sulla sequenza
aminoacidica di MICAL2. I due peptidi sono stati sintetizzati sia in forma libera che
coniugata. Abbiamo poi impiegato la forma coniugata di entrambi in un protocollo di
immunizzazione di conigli. I rispettivi antisieri prodotti sono stati validati attraverso
protocolli di dot blot ed ELISA usando come substrato i corrispondenti peptidi non
coniugati. Abbiamo inoltre usato il protollo di Western blot su substrato rappresentato da
estratti cellulari di cellule endoteliali che esprimono MICAL2 endogena.
Gli antisieri si sono mostrati specifici in tutti i saggi impiegati Siamo quindi passati a
caratterizzare l’espressione di MICAL2 mediante immunoistochimica su retina isolata di
topo (retinal flat mount). Questi studi hanno richiesto la costituzione ad hoc di una
colonia di topi (C57Bl6) sui cui neonati, a vari stadi di sviluppo post-natale, abbiamo
usato il saggio di retinal flat mount. Gli studi di retinal flat mount sono tuttora in corso.