• FAAH
• inibitori non covalanti
• virtual screening
• FLAP
• consensus docking

La FAAH (fatty acid amide hydrolase) è una proteina integrale di membrana costituita da 579 amminoacidi ed espressa a livello di numerosi tessuti, tra i quali cervello, intestino, fegato, testicoli, utero e rene. Essa è stata identificata come la principale idrolasi responsabile della degradazione dell’anandamide in vivo e, con differenti gradi di efficienza, di altre importanti etanolammidi endogene. La reazione enzimatica coinvolge un’atipica triade catalitica Ser-Ser-Lys, portando al rilascio di etanolammina e acidi grassi.
L’anandamide agisce principalmente come agonista sui recettori CB1 e CB2, ma la sua attività biologica è dovuta anche all’azione su ulteriori target, come i recettori GPR55, PPAR ed i canali vanilloidi TRPV1. Essa è implicata nella modulazione di processi neuro-comportamentali, infiammatori, metabolici, cardiovascolari e l’aumento dei suoi livelli endogeni è stato associato a numerosi effetti benefici.
Gli inibitori della FAAH sono stati ampiamente studiati in modelli in vivo per esplorare il potenziale terapeutico dato dall’inibizione di questo enzima. Ecco le principali applicazioni: infiammazione, dolore neuropatico e altre neuropatologie, ansia, depressione, diabete, obesità, ipertensione.

L’utilizzo di inibitori selettivi verso questo enzima è emerso come un approccio in grado di aumentare il tono endocannabinoide solo nei tessuti dove un tale aumento potesse essere favorevole, e allo stesso tempo di ridurre gli effetti indesiderati dati dagli agonisti diretti dei recettori CB (catalessi, ipo-locomozione, ipotermia). La maggior parte degli inibitori irreversibili e covalenti-reversibili mostra selettività per la FAAH nei tessuti cerebrali, ma possiede target addizionali in tessuti periferici come fegato e rene, tra cui molti isoenzimi coinvolti nel metabolismo di farmaci e profarmaci. La scoperta e lo sviluppo di inibitori prettamente non covalenti si pone come una valida strategia per cercare di migliorare il profilo di selettività e sicurezza mostrato dalle altre classi di inibitori, ed è stato perciò l’obbiettivo di questo progetto di tesi.

La prima parte dello studio è stata dedicata alla validazione di un procedura di virtual screening attraverso il software FLAP. Esso è in grado di esplorare lo spazio farmacoforico 3D di proteine e ligandi e di fornire informazioni quantitative e qualitative sulla complementarietà delle loro interazioni. Gli approcci offerti dal programma, sia di tipo ligand-based che receptor-based, sono stati testati; per tale scopo è stato creato un database di calibrazione, costituito da molecole appartenenti al database MUV e da 6 molecole attive sulla FAAH. Queste ultime sono state usate per valutare la performance dello screening.
La miglior procedura è stata utilizzata per filtrare un database commerciale di grandi dimensioni (database Enamine), confermando i risultati osservati nello screening di validazione.
Le molecole ottenute sono state sottoposte ad un robusto studio di consensus docking, sfruttando i seguenti sotware: Gold, Glide, Dock, Autodock, Fred, Vina. Le dieci pose ottenute per ogni ligando (una per metodo) sono state ordinate sulla base della reciproca distanza tra una pose e l’altra, utilizzando un software realizzato appositamente. Studi effettuati nei nostri laboratori hanno dimostrato come più una pose è predetta da diversi metodi più tale pose si avvicina a quella reale, così che un approccio di tipo consensus può essere utilizzato come indice di affidabilità di una pose derivante da studi di docking. Per questo motivo sono stati portati avanti nello studio soltanto quei composti la cui pose è stata predetta da un numero elevato di metodi.
Come ultimo passo è stata eseguita un’analisi di dinamica molecolare con il software AMBER11, in cui viene fornita energia e quindi libertà di movimento ai complessi proteina-ligando e ciò permette di valutarne la stabilità. La procedura è stata prima calibrata utilizzando un complesso cristallografico di riferimento contenente un inibitore non covalente, dimostrando come il composto mantenga per tutta la durata della dinamica un ottima stabilità all’interno del sito attivo.
Le molecole individuate al termine dell’intero protocollo verranno acquistate e sottoposte a saggi enzimatici per valutarne l’effettiva attività sull’enzima.