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Il presente lavoro di tesi si pone l’obiettivo di studiare una metodica basata sull’impiego di biosensori elettrochimici per la rilevazione di contaminanti chimici in matrici ambientali di origine marina e/o salmastra, finalizzata all’implementazione di ulteriori strumenti rapidi e di semplice esecuzione per la valutazione della qualità ecologica in ambiente marino.
A tale scopo sono stati utilizzati biosensori a base di DNA, come indicatori generali della presenza di composti tossici nell’ambiente. Questo sistema di misura non è esaustivo nel definire la tossicità di un campione, ma può essere molto utile per integrare altri sistemi, poiché può dare rapide e facili informazioni sulla presenza di composti che presentano affinità per il DNA. L’utilizzo di biosensori a DNA è giustificato dal notevole aumento osservato negli ultimi anni nell’uso degli acidi nucleici come strumento per il riconoscimento e il monitoraggio di molti composti di interesse analitico, ottenuto sfruttando l’interazione molecolare tra la superficie con il DNA immobilizzato e composti inquinanti o di interesse farmacologico. Strati di acidi nucleici combinati con trasduttori elettrochimici formano un nuovo tipo di biosensori di affinità per la determinazione di molecole a basso peso molecolare.
Per quanto concerne l’ambiente marino non esistono riferimenti bibliografici né metodologie standard applicabili, pertanto questo lavoro di tesi si è prefissato lo scopo di costruire un iter analitico valido per l’utilizzo dei biosensori elettrochimici in questo tipo di ambiente, basandosi sulla bibliografia nota riguardante gli studi effettuati con le stesse tecniche su acque dolci.
E’ stata studiata la possibilità di impiego di biosensori elettrochimici in grado di rilevare in tempi brevi modificazioni subite da filamenti doppi di DNA causate dall’interazione con altre molecole (per fenomeni di intercalazione o di natura elettrostatica). Tali interazioni possono ripercuotersi sulla struttura e sulle proprietà elettrochimiche del DNA e in particolare sull’ossidabilità della base guanina.
In particolare sono stati perseguiti tre obiettivi: 1) l’ottenimento di un segnale analitico facilmente misurabile e riproducibile; 2) l’applicazione del biosensore a campioni reali di interesse ambientale per una valutazione del rischio chimico e, potenzialmente, quello ecologico 3) l’applicazione di un sensore elettrochimico agli stessi campioni per la misura quantitativa del rilascio di rame e zinco.
Un biosensore può essere definito come un dispositivo analitico composto da un sistema di riconoscimento molecolare di origine biologica accoppiato con un sistema di trasduzione. Nel presente lavoro è stato utilizzato un biosensore elettrochimico realizzato immobilizzando sulla superficie di elettrodi DNA a doppio filamento estratto da timo di vitello e sfruttando un sistema di trasduzione voltammetrico.
Il cambiamento dell’ossidazione della base guanina è stato usato come segnale analitico e tale ossidazione è ottenuta mediante una voltammetria ad onda quadra (SWV).
Le misure elettrochimiche sono state eseguite con un potenziostato/galvanostato PalmSens (Palm Instrument BV, Houten, The Netherlands) collegato ad un computer con software PSlite in connessione con un agitatore HI 190 Hanna. Per le misure sono stati utilizzati elettrodi stampati monouso di varia composizione a seconda della metodica impiegata.
Lo studio può essere riassunto nei seguenti passaggi: 1) pretrattamento della superficie elettrodica con l’applicazione di un potenziale positivo al fine di ossidare le impurezze presenti sulla grafite e per ottenere uno strato superficiale più idrofilico che facilita l’adsorbimento del DNA; 2) immobilizzazione del DNA 3) interazione del biosensore con il mezzo (acqua di mare) e i contaminanti organici (2-aminoantracene) e inorganici (CuSO4 e ZnSO4) utilizzati come tossici di riferimento per le curve di taratura; 4) interrogazione elettrochimica della superficie elettrodica; 5) misure su campioni reali (es. matrici di sedimento, acque di rilascio di prodotti antifouling); 6) confronto dei risultati ottenuti dal biosensore a DNA con risultati ottenuti da misurazioni quantitative di metalli pesanti effettuate sugli stessi campioni reali utilizzando un sensore elettrochimico; 7) analisi statistica dei risultati ottenuti dalle misurazioni.