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Le neurotrofine sono una famiglia di fattori di crescita coinvolta in una moltitudine di processi biologici quali: sviluppo, differenziamento e sopravvivenza dei neuroni, così come plasticità neuronale e percezione fisiopatologica del dolore. In particolare, queste proteine sono secrete in modeste quantità dalle cellule bersaglio, ovvero le cellule che devono stabilire un contatto con il neurone. Queste cellule possono essere a loro volta di tipo nervoso o di altro tipo. La famiglia delle neurotrofine comprende diversi membri tra i quali il Nerve Growth Factor (NGF). Il meccanismo generale di azione delle neurotrofine prevede il riconoscimento di queste da parte di recettori posti sulla membrana neuronale, l’endocitosi del complesso neurotrofina-recettore all’interno di endosomi speciallizzati, ed il trasporto di questi dal tip assonale verso il soma neuronale dove si espleta la loro funzione biologica. Per quanto riguarda il NGF, essa viene secreta dai tessuti target sottoforma di mix proteico costituito anche dalla sua forma immatura non processata (proNGF). E’ stato dimostrato che in condizioni patologiche, quali ad esempio malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, vi è uno sbilanciamento tra le concentrazioni rispettive delle forme matura e non matura del NGF, con un aumento a favore di quest’ultima. Ulteriori indagini hanno mostrato che, sebbene molto simili strutturalmente, il NGF ed il proNGF possiedono ruoli contrapposti, promuovendo rispettivamente la sopravvivenza oppure la morte neuronale.
La presente tesi si pone l’obiettivo di caratterizzare i determinanti molecolari alla base delle differenze nella funzione biologica del NGF e del proNGF. Per raggiungere questo obiettivo il laboratorio BioSNS del Prof. Cattaneo alla Scuola Normale Superiore ha ideato una strategia per inserire un peptidedi 11 amminoacidi al C-terminale di entrambe le neurotrofine. Questo costituisce un “tag chimico”, che può essere covalentemente funzionalizzato con stechiometria 1:1 a piccoli fluorofori organici con minimo impatto sulla struttura sia del NGF che del proNGF. Il mio lavoro di tesi è inserito in questa tematica di ricerca ed è stato articolato nei seguenti punti:
i) Produzione di NGF e proNGF taggati in E.coli e loro purificazione tramite cromatografia a scambio ionico FPLC.
ii) Marcatura delle neurotrofine taggate purificate con fluorofori organici, e successiva purificazione delle forme fluorescenti tramite un ulteriore step di purificazione in HPLC.
iii) Validazione funzionale delle neurotrofine fluorescenti così ottenute tramite utilizzo di una piattaforma microarray; in particolare sono stati valutati i profili di espressione genica attivati dalla somministrazione delle neurotrofine fluorescenti a una coltura cellulare di feocromocitoma di ratto (PC12), tipicamente usata per lo studio delle neurotrofine.
iv) Somministrazione delle neurotrofine fluorescenti validate in cellule PC12 seminate su vetrino e successiva immunocitochimica e microscopia confocale per valutare la loro evenutale colocalizzazione con alcuni partner proteici noti coinvolti nel signalling e nel trasporto delle neurotrofine all’interno dei neuroni, quali: TrkA, P75 e Sortilin. Questi partner possiedono diversa affinità per le due forme proteiche del NGF, inoltre sono caratterizzati da risposte cellulari opposte. Analisi di immagine quantitativa e qualitativa della colocalizzazione di NGF e proNGF con i vari partner proteici.