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Negli ultimi anni la ricerca ha rivolto sempre maggiore attenzione nei confronti dell'epigenetica. In particolare, molti studi si sono concentrati sui meccanismi attraverso i quali le modificazioni covalenti di proteine istoniche, con conseguente rimodellamento della cromatina, riescono ad influenzare la regolazione genica. Tra le possibili modificazioni istoniche, la metilazione delle lisine dell’istone H3 svolge un ruolo peculiare potendo risultare in attivazione o repressione trascrizionale a seconda delle specifiche lisine metilate. Le reazioni di metilazione sugli istoni non sono irreversibili, come era stato ipotizzato in passato, infatti da ormai diversi anni sono stati scoperti particolari enzimi responsabili delle reazioni di demetilazione: le istone demetilasi.
Il presente lavoro di tesi è incentrato sul ruolo svolto durante la retinogenesi da JHDM1D, una istone demetilasi della famiglia Jumonji, in particolare studiandone specifiche interazioni funzionali con altri fattori retinici.
Nel nostro laboratorio, sono stati precedentemente effettuati studi funzionali sul gene jhdm1d che hanno mostrato come sia la perdita che il guadagno di funzione portino ad un aumento del numero dei fotorecettori associato ad una riduzione delle cellule bipolari.
In questo lavoro di tesi, abbiamo voluto studiare se la proporzione relativa dei due sottotipi di fotorecettori potesse essere influenza dall'azione della JHDM1D. Inoltre, essendo noto che le diverse sottopopolazioni retiniche, tra cui coni, bastoncelli e cellule bipolari, vengono generati in tempi diversi durante la retinogenesi, i nostri risultati potrebbero essere utili per comprendere il ruolo della JHDM1D nella sequenza di specificazione delle varie popolazioni cellulari retiniche. A questo scopo abbiamo sovraespresso jhdm1d insieme alla Green Fluorescent Protein (GFP) nel blastomero D1.2 allo stadio di 16 cellule, in modo da generare cloni retinici nei quali e’ stata quantificata a fine retinogenesi (stadio 42) la presenza di bastoncelli mediante immunostaining con anticorpo anti-rodopsina. Questa analisi ha mostrato che la sovraespressione di jhdm1d, rispetto a controlli iniettati con la sola GFP, porta ad un significativo incremento della percentuale di bastoncelli rispetto ai coni.
Sono stati condotti poi esperimenti riguardanti l'effetto della perdita di funzione di jhdm1d, ottenuta mediante microiniezioni di oligonucleotidi antisenso morpholino nel blastomero D1.2 allo stadio di 16 cellule, e verificati gli effetti sulla generazione dei due tipi di fotorecettori mediante reazioni di immunostaining su sezioni di retina utilizzando anticorpo anti-rodopsina. È stato visto che il knock-down di jhdm1d non altera le proporzioni di coni e bastoncelli nelle retine mature.
Un’altra istone demetilasi della famiglia Jumonji espressa nella retina e’ JMJD3. In particolare, mentre JHDM1D rimuove gruppi mono e di-metilici dalle lisine 9 e 27 dell'istone H3, JMJD3 rimuove la di- e tri-metilazione dalla lisina 27 dell'istone H3. Abbiamo quindi ritenuto interessante valutare se l’effetto osservato per la sovraespressione di jhdm1d fosse specifico confrontandolo con l’attivita’ retinica di JMJD3. Abbiamo percio’ iniettato gli mRNA codificanti per JMJD3 e GFP nel blastomero D1.2 ed abbiamo trattato le sezioni di retina con hoechst, eseguendo infine la conta dei tipi cellulari GFP-positivi nella retina completamente differenziata. Da questi esperimenti è emerso che la sovraespressione di jmjd3 provoca una diminuizione delle cellule amacrine rispetto ai controlli, svolgendo quindi, durante la retinogenesi, un ruolo distinto da quello di JHDM1D.
Dato che uno dei risultati dell’azione di JMJD3 e’ di generare lisine 27 mono- e dimetilate sull’istone H3, che sono a loro volta substrato per JHDM1D, abbiamo indagato su quale possa essere l’effetto della sovraespressione di entrambe le demetilasi.
La co-sovraespressione ha indotto un aumento significativo delle cellule orizzontali e amacrine rispetto alle retine di controllo, un effetto del tutto differente dalla sovraespressione dei singoli geni.
Per verificare se la generazione dei fotorecettori promossa dalla sovraespressione di jhdm1d sia mediata da Crx-b, un determinante cruciale dei fotorecettori, abbiamo pensato che un esperimento utile in futuro sara’ iniettare in blastomeri D 1.2 a stadio di 16 cellule il trascritto di jhdm1d insieme a Crx-b engrailed repressor (Crx-b EngR), un dominante negativo in grado di reprimere la trascrizione dei geni normalmente attivati dalla proteina Crx-b endogena. In questo lavoro di tesi sono state saggiate tre dosi di Crx-b EngR (50 pg, 75 pg e 100 pg) al fine di individuare quella ottimale da poter poi iniettare, per studi futuri, insieme a jhdm1d. La dose ottimale che ha mostrato effetti a livello delle cellule retiniche è stata quella di 75 pg, che ha provocato una diminuizione significativa delle cellule amacrine.
Infine, per capire se alcuni effetti della sovraespressione di jhdm1d fossero gia’ rilevabili a livello di espressione genica in una fase più' precoce della retinogenesi, abbiamo analizzato, mediante esperimenti di ibridazione in situ, l’espressione di Crx-b, Ngn (entrambi induttori di fotorecettori) e Hermes (un marcatore di cellule gangliari) in embrioni a stadio 33/34 precedentemente iniettati in un blastomero dorsale allo stadio di 4 cellule con jhdm1d. La mancanza di cambiamenti significativi dell’espressione dei geni analizzati, osservata nella maggior parte dei casi, suggerisce che l’azione di JHDM1D sia ristretta a fasi successive della retinogenesi.