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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-03222019-153754


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale LM5
Autore
ZONGO, TATIANA MARIA ABILIO
URN
etd-03222019-153754
Titolo
Purificazione di alpha proteine plasmatiche con potenziale uso terapeutico in patologie rare
Dipartimento
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Relatori
relatore Prof.ssa Orlandini, Elisabetta
relatore Dott. Mori, Filippo
Parole chiave
  • transtiretina
  • purificazione di alpha proteine plasmatiche
  • patologie rare
  • ceruloplasmina
Data inizio appello
10/04/2019
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
10/04/2089
Riassunto
La transtiretina e la ceruloplasmina sono due alpha proteine plasmatiche.
La transtiretina (TTR) è principalmente una proteina carrier dell’ormone tiroideo e del retinolo, grazie al suo legame con una proteina chaperon chiamata Retinol Binding Protein (RBP). Sintetizzata nel fegato, nel plesso coroideo e in piccole quantità nella retina, in condizioni fisiologiche ottimali, circola nel sangue o nel liquido cerebrospinale come una proteina solubile. Nel SNC svolge un’azione di trasporto dell’ormone tiroideo indipendentemente dal trasporto sistemico. Svolge anche altre attività secondarie implicate nella regolazione di processi intracellulari come la rigenerazione dei nervi, il processo auto-fagico e l’omeostasi del glucosio. Inoltre ha un’azione di proteolisi poiché è in grado di chelare lo ione zinco.
Oltre 100 mutazioni del gene TTR (codificante per la transtiretina) possono influire notevolmente sulla stabilità della sua struttura tetramerica, favorendone la dissociazione e la formazione di aggregati amiloidi nello spazio interstiziale importanti per la patogenesi di alcune malattie rare denominate amiloidosi da TTR, conosciute come: amiloidosi senile sistemica, polineuropatia amiloide familiare e cardiomiopatia amiloidotica familiare.

La ceruloplasmina (CER) è quasi interamente prodotta nel fegato e la sua principale funzione è di trasportare il 95% del rame nel plasma. Grazie alla presenza di sei ioni rame nella sua struttura, è in grado di svolgere l’importante attività ferrosidasica (da Fe2+ a Fe3+), un fenomeno chiave nel metabolismo del metallo: i macrofagi al termine della fagocitosi e della digestione dei globuli rossi rilasciano ferro in gran parte nello stato ferroso (Fe2+), che per essere recuperato attraverso il ciclo della ferritina e della transferrina deve essere ossidato allo stato ferrico (Fe3+).
La proteina svolge inoltre un’attività scavenger dei radicali liberi e ioni superossido: si comporta come una proteina di fase acuta nel processo flogistico aumentando i propri livelli nel siero, in seguito a traumi, nelle donne in gravidanza e, dopo l’infarto del miocardio e in alcuni tipi di cancro.
La carenza o la mancata sintesi della proteina, derivata da mutazioni genetiche o concentrazioni ematiche troppo basse del rame, possono essere la causa di malattie rare come ad esempio l’aceruloplasminemia.
L’assenza della ceruloplasmina causa un’alterazione nell’omeostasi del ferro con conseguente accumulo del metallo nei tessuti.
Lo scopo di questa tesi: è la messa a punto di un processo cromatografico efficiente, scalabile a livello industriale, che permetta di ottenere un concentrato sia di ceruloplasmina sia di transtiretina a elevato grado di purezza, a partire da un derivato plasmatico.
Tra gli intermedi del frazionamento plasmatico di Cohn è stata individuata la frazione più arricchita delle due proteine. Questa è stata sottoposta a varie prove di estrazione, al fine di migliorare la concentrazione delle due proteine nell’estratto. L’ottimizzazione è stata possibile grazie alla valutazione di più parametri: la provenienza del plasma pool da cui è stato ottenuto la frazione scelta, l’omogeneità del campione nel processo di produzione e la forza ionica del tampone d’estrazione.
E’ stata quindi ricercata una resina cromatografica che potesse garantire un buon recupero delle due proteine d’interesse. Sono così state individuate e testate diverse resine: (a scambio anionico debole, a scambio anionico forte e mix mode) che per le loro caratteristiche in termini di matrice, ligando, dimensioni delle particelle e porosità, potevano essere adatte alla purificazione delle due proteine; nella loro scelta si è inoltre tenuto conto di proprietà quali la capacità di carico, la resistenza meccanica e la facilità di sanitizzazione della stessa resina, caratteristiche di rilevante importanza in un’ottica di processo industriale. Tutte le corse cromatografiche sono state condotte caricando il campione in condizioni tali da favorire il legame della trastiretina e ceruloplasmina alla resina e utilizzando un gradiente a forza ionica crescente per la sua eluizione dalla colonna: in questo modo è stato possibile raccogliere le due proteine di interesse dopo che le proteine non legate, o comunque trattenute più debolmente, sono state allontanate utilizzando tamponi di lavaggio a concentrazione ionica minore. Tra le resine testate, quella a scambio anionico forte, si è dimostrata nettamente la più efficace nella purificazione delle due proteine. Su questa resina è stato quindi messo a punto, attraverso l’esecuzione di numerose corse cromatografiche un efficiente processo di purificazione scalabile a livello industriale. Considerati i risultati positivi ottenuti, sono state condotte ulteriori prove in modo da stabilire le condizioni sperimentali più adatte (forza ionica e pH dei tamponi utilizzati) per l’ottenimento di un prodotto che presenti non solo un’elevata resa di ceruloplasmina e transtiretina ma anche buono indice di purificazione. L’eluato ottenuto è stato caratterizzato identificando anche le principali proteine inquinanti. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il processo cromatografico messo a punto può essere utilizzato con successo come primo step nella purificazione delle proteine d’interesse.
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