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Tesi etd-03222010-100707


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
DE GREGORIO, VERONICA
URN
etd-03222010-100707
Title
Estrazione e purificazione dell'enzima gamma-glutammiltransferasi da piastrine di origine umana. Confronto con la GGT plasmatica.
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE FISIOPATOLOGICHE GENERALI
Commissione
relatore Franzini, Maria
tutor Paolicchi, Aldo
Parole chiave
  • cromatografia
  • piastrine
  • GGT
  • siero
Data inizio appello
26/04/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
26/04/2050
Riassunto analitico
La gamma-glutammiltransferasi (GGT) è un enzima localizzato sulla membrana plasmatica della maggior parte delle cellule e catalizza il primo passaggio del processo di degradazione del glutatione. In condizioni fisiologiche l’enzima è presente preferenzialmente a livello di tessuti epiteliali implicati in attività secretorie e di assorbimento, sebbene mostri una notevole eterogeneità di espressione sia spaziale che temporale. La GGT presente nel siero si pensa sia di origine epatica, anche se non è escluso che altri organi/tessuti possano contribuire. L’enzima GGT è presente anche nella maggior parte dei leucociti e delle piastrine ed è localizzato sia a livello della membrana plasmatica sia nei granuli di secrezione. <br>Lo scopo della tesi è quello di estrarre e purificare l’enzima GGT da piastrine di origine umana e di confrontare le sue proprietà chimico fisiche con quelle della GGT di origine plasmatica per evidenziarne le caratteristiche specifiche e distintive. <br>Inizialmente è stato necessario individuare una metodica che consentisse di isolare le piastrine dal resto delle componenti plasmatiche senza indurre aggregazione e attivazione, processi che determinerebbero la degranulazione delle piastrine con conseguente rilascio nell’ambiente extracellulare del materiale contenuto nei granuli piastrinici, tra cui l’enzima GGT di interesse. <br>L’attività totale di GGT nelle piastrine isolate è stata quantificata utilizzando un substrato cromogeno specifico per l’enzima, gamma-glutammil-p-nitroanilide; la GGT agisce su tale substrato scindendo il legame gamma-glutammilico e liberando paranitroanilina, che presenta un picco massimo di assorbimento a 405 nm.<br>Dopo aver individuato l’espressione dell’ enzima a livello delle piastrine si è indagato sulle sue caratteristiche chimico fisiche; è stato inoltre operato un confronto tra la GGT sierica e quella piastrinica. La metodica utilizzata per la caratterizzazione della GGT è la cromatografia ad esclusione molecolare. La cromatografia è un processo di analisi che si utilizza per separare sostanze aventi elevato peso molecolare, soprattutto proteine e macromolecole. Alla base di questa separazione vi è una fase stazionaria, costituita da un supporto inerte con pori di dimensioni controllate, e una fase mobile, che consiste in un solvente organico o acquoso che eluisce i soluti attraverso la colonna. Sarà inoltre di supporto allo studio anche la cromatografia a scambio anionico, tecnica che prevede la separazione delle proteine in base alla carica posseduta. La carica della proteina GGT dipende dal contenuto in acido sialico che è noto essere tessuto specifico.<br><br>
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