• BTK
• Ibrutinib
• linfoma
• TCL1

Il sistema linfatico ha il compito di drenare i fluidi dalle cellule e dai tessuti verso il flusso sanguigno e combattere le infezioni dovute ad agenti esterni. La linfa circola nell’organismo attraverso i vasi linfatici. I suoi costituenti principali, oltre ai grassi e alle proteine, sono i linfociti, cellule essenziali per il corretto funzionamento del sistema immunitario. I linfomi sono tumori causati dalla proliferazione incontrollata di tali cellule. Poiché le mutazioni che possono insorgere nelle diverse fasi dello sviluppo del linfocita sono molteplici, le cause esatte di sviluppo neoplastico rimangono ancora sconosciute. Tra le potenziali cause responsabili dell’insorgenza della patologia (linfomagenesi) vi sono fattori genetici, l’indebolimento del sistema immunitario (mancato riconoscimento di cellule anomale) e alcune forme virali. Il risultato è comunque una replicazione linfocitaria incontrollata e la perdita della capacità di andare incontro a morte programmata. L’accumulo di linfociti si manifesta in diverse parti del corpo, seguito dall’invasione degli organi del sistema linfatico, tra cui i linfonodi, che subiscono un ingrossamento progressivo. I linfociti possono essere classificati in due tipi principali: - cellule B, che si sviluppano nel midollo osseo e una volta diventate mature evolvono in plasmacellule, deputate a produrre anticorpi necessari a combattere le infezioni; - cellule T, il cui sviluppo è localizzato a livello del midollo osseo ma migrano e maturano successivamente nel timo, dove sono deputate al controllo delle reazioni immunitarie e all’attivazione delle cellule B. Numerosi sono i tipi di linfomi finora caratterizzati, che possono essere divisi in due grandi categorie, Hodgkin e non Hodgkin, che comprendono vari sottotipi caratterizzati da differente aggressività. Il linfoma di Hodgkin (LH) è dovuto alla trasformazione dei linfociti B in un tipo particolare di cellule pluri-nucleate, con una morfologia peculiare che non assomiglia a nessuna delle normali cellule presenti nel nostro organismo. Nel linfoma non-Hodgkin (LNH), che si manifesta con incidenza maggiore, possono essere invece coinvolte entrambe le tipologie di linfociti B e T.
Data la vasta eterogeneità che caratterizza questa patologia, il trattamento terapeutico specifico dipende dalla tipologia di linfoma, dalla velocità di progressione e dalle caratteristiche delle cellule coinvolte. Uno dei farmaci approvato dalla FDA (Food and Drug Administration) per la cura del linfoma è l’Ibrutinib. Al momento dell’approvazione, avvenuta nel 2013, tale farmaco venne considerato fortemente innovativo, e la sua applicazione clinica si è rivelata valida soprattutto per i pazienti che non tollerano i trattamenti immuno-chemoterapici convenzionali. L’Ibrutinib è un farmaco molto potente, che ha mostrato un IC50 di 0,5 nM nei confronti del suo target principale, la Bruton-tirosin chinasi. BTK appartiene alla famiglia delle chinasi Tec, la seconda famiglia più grande di tirosine chinasi non recettoriali, e riveste un ruolo chiave nel pathway BCR (B-cell receptor). Il pathway BCR è un sistema di segnalazione fondamentale per la crescita e sopravvivenza delle cellule tumorali. La proteina BCR si trova sulla membrana delle cellule tumorali; quando questa riconosce un agente patogeno, stimola la proliferazione di linfociti B che neutralizzano l’infezione attraverso la produzione di anticorpi selettivi. Successivamente all’attivazione di BCR, BTK viene fosforilato dalle chinasi intracellulari LYN (Tyrosine-protein kinase) e SYK (Spleen tyrosine kinase). Tali processi portano all’attivazione di PLCγ2 (1-fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato fosfodiesterasi gamma-2), che promuove il rilascio di calcio intracellulare, DAG (diacilglicerolo) e IP3 (inositolo trifosfato). Questa cascata di segnalazione (Figura 1) promuove l’attivazione del fattore nucleare NF-kB, implicato nella regolazione dell’espressione genica, nella crescita cellulare e nell’inibizione dell’apoptosi delle cellule B. Ibrutinib inattiva la BTK attraverso la formazione di un legame covalente irreversibile con un residuo di Cys481 nella tasca di legame dell’ATP presente in BTK. Tale legame inibisce l’autofosforilazione di BTK sulla Tyr223 bloccando la trasduzione del segnale del pathway BCR e causando così la morte delle cellule B maligne. Tuttavia, Ibrutinib non è un inibitore selettivo per BTK e la sua attività off-target su altre chinasi è stata correlata all’insorgenza di effetti collaterali. Inoltre, sono stati riscontrati casi di resistenza acquisita ad Ibrutinib dovuti essenzialmente alla mutazione a carico del residuo di Cys481 di BTK con un residuo serinico che impedisce l’interazione covalente del farmaco. In seguito a questa mutazione la proteina BTK mostra una ridotta affinità per Ibrutinib che interagisce con la proteina mutata in modo reversibile, diminuendo quindi la capacità del farmaco di inibire la fosforilazione di BTK mutante. Per questo motivo, la ricerca si è orientata verso lo sviluppo di nuovi e più selettivi inibitori di BTK definiti inibitori di seconda generazione. Studi effettuati su diverse forme di linfoma, hanno permesso di identificare la proteina TCL1 (T-cell leukemia/lymphoma 1) come nuovo importante target antitumorale. TCL1 è una proteina omodimerica di 13kDa prodotta dell’oncogene TCL1. Lesioni a carico dell’oncogene TCL1 determinano l’acquisizione di una funzione anomala e incontrollata della cellula. TCL1 è il capostipite delle proteine dell’omonima famiglia, coinvolte nello sviluppo normale delle cellule B e T. È fisiologicamente espressa nei tessuti fetali e nei linfociti allo stadio precoce di sviluppo, mentre la sua espressione è fortemente deregolata nella linfomagenesi.
TCL1 svolge un ruolo chiave nel regolare una serie di proteine coinvolte nella mediazione dei processi di proliferazione, sopravvivenza e differenziazione cellulare, come ATM (Ataxia-telangiectasia mutated), IkBα (Inhibitor of NF-kB), HSP70 (Heat shock protein 70 kilodaltons) e TP63 (Tumor protein p63) (Figura 2). È stato inoltre confermato il coinvolgimento di TCL1 nella regolazione del pathway NF-kB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), e nell’attivazione del pathway pro-oncogeno PI3K (Phosphoinositide 3-kinase) /AKT (Protein kinase B) /mTOR (Mammalian target of rapamycin), la cui stimolazione determina un’amplificazione della linfomagenesi. TCL1 interagisce inoltre con il pathway BCR (B-cell receptor) mediante l’interazione col recettore ROR1 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1) e l’inibizione della proteina PTPROt (Protein tyrosine phosphatase receptor-type O truncated). Sulla base delle importanti implicazioni sulle funzioni cellulari di TLC1 e BTK, un approccio farmaceutico “multi-target”, mirato ad ottenere la simultanea inibizione di entrambi i target con una molecola duale potrebbe rappresentare una strategia innovativa per lo sviluppo di nuovi inibitori efficaci nel trattamento dei linfomi. L’inibizione contemporanea di due proteine coinvolte in pathway di segnalazione cellulare distinti potrebbe offrire anche l’opportunità di prevenire l’insorgenza di meccanismi di farmacoresistenza. Su queste basi, nel laboratorio dove ho svolto la mia tesi di laurea sono state sintetizzate nuove molecole ad attività inibitoria duale TCL1/BTK, a partire dalla struttura dell’Ibrutinib (Figura 3). Le principali modifiche apportate sono: - la sostituzione del nucleo centrale 4-amino-pirazolopirimidinico con uno scaffold 8-fenil-chinazolin-4-onico; - la trasformazione del sostituente acriloil-piperidinico (o piperidinil-prop-2-en-1-one) in metil-piperazina (composto 1), piperazina (composto 2), o in acriloil-piperazina (composto 3). La strategia sintetica seguita e la caratterizzazione degli intermedi e dei prodotti finali saranno l’oggetto di questa tesi di laurea.