• stress ossidativo
• sovraespressione
• piante transgeniche
• PaGAST
• gibberelline

I geni GA-stimulated transcript (GAST) sono diffusi in molte mono- e dicotiledoni e il primo membro di questa famiglia, GAST1, è stato identificato nel 1992 nel pomodoro (Solanum lycopersicum). Questi geni codificano per piccole proteine contenenti un peptide segnale all’N-terminale (18-29 residui, importante per la localizzazione subcellulare della proteina), una regione variabile, e un dominio al C-terminale detto dominio GASA (circa 60 residui). Quest’ultimo è molto conservato, infatti contiene 12 cisteine che ritroviamo nelle stesse posizioni in ogni proteina di questa famiglia. I geni GAST sono implicati nella risposta della pianta agli ormoni; in particolar modo vengono indotti dalle gibberelline, ma è stato visto che anche altri fitormoni possono indurne o inibirne l’espressione. Hanno, dunque, un ruolo in processi come lo sviluppo delle radici, la maturazione del frutto, l’espansione dei tessuti. Recentemente però è stata rilevata l’espressione dei geni GAST a seguito di stress sia di tipo biotico che abiotico, in particolar modo stress ossidativo. È stato, dunque, ipotizzato che le 12 cisteine conservate, che possono formare 5 ponti disolfuro, possano avere un ruolo importante nello stabilizzare la proteina e nel funzionare come siti redox, ed esercitare così una funzione protettiva per questo stress. Ad esempio, è stato visto che PaGAST, gene di 312 bp della famiglia GAST di Populus alba conferisce nei batteri di E. coli che esprimono questa proteina resistenza allo stress ossidativo indotto da perossido di idrogeno e ossido nitrico. In questa tesi è stato valutato questo effetto in vivo, utilizzando piante di Arabidopsis thaliana sovraesprimenti PaGAST fusa con GFP, in modo da poterne valutare anche la localizzazione nei vari organi. Per creare le piante transgeniche è stato usato agrobatterio, ceppo GV3101, che portava il vettore pMDC83 contenente il nostro gene PaGAST fuso a GFP e una resistenza all’Igromicina. Mediante la tecnica del Floral Dip sono state immerse le infiorescenze di piante WT nell’inoculo batterico, in modo tale da far avvenire il trasferimento di DNA da agrobatterio alla pianta. Sono stati raccolti i semi da queste piante, e sono stati seminati su terreno MS contenente Igromicina in modo da selezionare le piante che avevano acquisito il transgene. Da questo screening è stata così ottenuta la prima generazione di piante transgeniche T1, di cui sono state selezionate 4 piantine (GAST-GFP 1-2-3-4); per analizzare se avessero effettivamente acquisito il transgene è stata effettuata un’estrazione di DNA dalle foglie, seguita da una amplificazione mediante PCR usando primers disegnati entrambi sul gene PaGAST. È stata poi creata una seconda generazione T2, attraverso una nuova semina su Igromicina. Su queste piante è stata studiata la localizzazione della proteina PaGAST tramite analisi al microscopio confocale; è risultato che la proteina localizza maggiormente a livello dei vasi conduttori delle radici, nella foglia, in associazione alle nervature e nella zona di espansione fogliare, nelle silique, nel tegumento del seme; bassi livelli sono stati riscontrati invece nel fusto. Per testare se PaGAST conferisse o meno resistenza agli stress, le linee GAST-GFP1-2-3 sono state seminate in terreni contenenti agenti che inducessero stress ossidativo quali l’erbicida metil-viologeno (Paraquat) (0,1 µM, 0,25 µM, 0,5 µM, 1 µM), metalli come Cu (25 µM, 40 µM, 50 µM), Zn (250 µM, 400 µM, 500 µM), e agenti che inducessero stress osmotico come NaCl (50 mM, 100 mM, 150 mM). La germinazione e la crescita in 10 giorni delle piante transgeniche è stata confrontata con quelle di piante WT seminate nelle stesse condizioni. Dai risultati è emerso che la resistenza agli stress mostrata in vitro non è stata confermata in vivo.