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BRAF è una serina/treonina chinasi che attiva il pathway delle MAP chinasi, RAS/RAF/MEK/ERK, promuovendo la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la motilità e inibendo il differenziamento. BRAF è spesso mutato nei tumori in particolare nel melanoma. Il 98% delle mutazioni di BRAF consiste nella sostituzione di un residuo di valina (V) con uno di glutammato (E) in posizione 600 (BRAFV600E). Questa mutazione rende l'attivazione di BRAF indipendente dalla dimerizzazione indotta da RAS permettendo alla proteina di essere costitutivamente attiva sotto forma di monomero. La mutazione V600E rende perciò le cellule tumorali capaci di proliferare in maniera incontrollata. Inoltre è stato recentemente osservato che tutte le cellule tumorali umane esprimono a livelli comparabili sia la variante Reference di BRAF sia l’isoforma X1 che differiscono a livello della regione C-terminale. Vista l'elevata percentuale di casi di melanoma che portano la mutazione V600E e il vantaggio che essa comporta a favore della progressione del fenotipo tumorale, BRAFV600E è stata scelta come bersaglio per lo sviluppo di inibitori specifici a scopo terapeutico (es. Vemurafenib). Tuttavia l'uso di questi inibitori ha mostrato diversi effetti collaterali, primo fra tutti la resistenza acquisita al farmaco.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è di identificare e caratterizzare interattori funzionali della proteina BRAFV600E utilizzando il lievito Saccharomyces cerevisiae.
S. cerevisiae rappresenta un ottimo sistema modello, dal momento che circa il 50% dei geni umani coinvolti in malattie ha l'ortologo in lievito. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che è possibile studiare l'attività di proteine eterologhe in lievito anche in assenza del loro ortologo. Infatti, sebbene BRAF non abbia l'ortologo in lievito, S. cerevisiae presenta il pathway delle MAP chinasi che è coinvolto in diverse funzioni cellulari tra le quali anche la risposta adattativa a condizioni di stress salino. Nel nostro laboratorio è stato visto che in condizioni normali di crescita l'espressione della proteina BRAF in lievito non conferisce alcun fenotipo particolare, tuttavia l'espressione di BRAFV600E permette al lievito di sopravvivere in condizioni di iperosmolarità.
È stato dimostrato infatti che BRAFV600E funziona in lievito nel pathway di HOG, in particolare complementa l'assenza delle MAP chinasi ste11, ssk2 e ssk22.
Per identificare nuovi interattori di BRAF sono state utilizzate due strategie sperimentali: lo screening di una library di cDNA e l'Yeast Deletion Pool (YDP).
La prima strategia sperimentale consiste nello screening di una library di cDNA umani estratti da cellule HeLa. Il ceppo utilizzato manca delle fosfatasi PTC1 e PTP3 che in condizioni di stress salino mantengono HOG fosforilato entro certi limiti compatibili con la vita. Esprimendo BRAFV600E nel ceppo ptp3Δptc1Δ, il pathway è costitutivamente attivo, HOG viene iperforsforilato e il lievito non è capace di sopravvivere. Lo screening consiste nella co-trasformazione del ceppo ptp3Δptc1Δ con pESC-BRAFV600E e con la library di cDNA umani estratti dalle cellule HeLa all'interno del vettore pYES2. I cloni sono stati selezionati grazie al terreno selettivo privo di uracile e leucina che rappresentano rispettivamente i marcatori di selezione di pYES2 e di pESC. Questi cloni contengono un cDNA che codifica per una proteina umana che interagisce funzionalmente con BRAFV600E impedendole di iperfosforilare HOG e inibire la sopravvivenza cellulare. Per poter utilizzare i marcatori LEU2 e URA3 è necessario costruire un ceppo ptp3Δptc1Δ che non li contiene. A tale scopo è stata realizzata la delezione del gene PTP3 nel ceppo ptc1∆ tramite la strategia di mutagenesi sito-diretta specifica per il lievito, definita “Delitto Perfetto”. Questa tecnica consiste nell'inserimento gene-specifico di una cassetta contente due marcatori URA3 e Hyg che conferisce resistenza all'igromicina. Successivamente la cassetta viene tolta lasciando la delezione del gene senza marcatori. Sia l'inserimento che la rimozione della cassetta si servono della ricombinazione omologa che nel lievito risulta molto efficiente.
I cDNA identificati attraverso questo screening verranno analizzati in silico andando ad osservare i livelli di espressione delle cellule tumorali umane e in questo modo selezionati per successive validazioni in vivo.
L’altra strategia sperimentale è stata realizzata utilizzando l’Yeast Deletion Pool. L’YDP rappresenta una collezione di circa 4700 cloni di lievito ciascuno deleto per un solo gene non essenziale. In ciascun ceppo appartenente all’YDP la delezione genica si realizza sostituendo l’intera ORF con una cassetta contenente un marcatore di selezione e due sequenze, di 20 nucleotidi ciascuna, che funzionano da “molecular barcode”. L'YDP è stato trasformato con il vettore pYES2 vuoto e con entrambe le isoforme di BRAFV600E. Il plasmide pYES2 contiene il marcatore URA3 che consente di selezionare i trasformanti in terreno privo di uracile. Successivamente, dato che la proteina si trova sotto il controllo del promotore inducibile da galattosio, è stata indotta l'espressione di BRAF trasferendo la coltura nel mezzo contente galattosio. Infine metà di questa coltura è stata sottoposta a un periodo di crescita in condizioni di stress salino. Da ciascuna coltura è stato estratto il DNA genomico ed è stata effettuata una PCR con primer universali per amplificare i ‘molecular barcode’ presenti in ciascun campione. Il prodotto di PCR è stato poi sottoposto al deep sequencing dei barcode al fine di identificare quali geni, se deleti, conferiscono una maggiore/minore fitness di crescita in presenza di BRAFV600E rispetto al vettore vuoto e quindi rappresentano potenziali interattori funzionali di questa proteina.