• gene targeting
• mesotelioma pleurico maligno
• RNA interference

Introduzione: Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è una rara neoplasia della pleura altamente aggressiva e con prognosi infausta.
L’esposizione all’asbesto è il fattore di rischio principale con un periodo di latenza della malattia di circa 30-40 anni. Ad oggi, il MPM è un tumore difficile da diagnosticare in fase precoce, e non è ancora presente un’efficace strategia terapeutica. A tal fine, l'identificazione dei cambiamenti dell’espressione genica nelle cellule tumorali mesoteliali può portare ad una migliore comprensione della patogenesi del MPM e all’individuazione di nuovi biomarcatori con una potenziale applicazione clinica.
Lavoro precedentemente svolto: La presente ricerca fa parte di un progetto più ampio al fine di identificare i geni differenzialmente espressi tra tessuti di mesotelio sano e patologico. Da un’intensa revisione della letteratura su studi di trascrittomica è emerso che dei 931 geni candidati solo 119 risultano deregolati in almeno due gruppi di ricerca differenti. I livelli di espressione dei 119 geni sono stati verificati in tessuti di MPM e in pleure non maligne mediante Real Time-PCR. I geni risultati sovra-espressi sono stati ulteriormente valutati in due linee cellulari di MPM e paragonati alla linea Met-5A (immortalizzata non maligna).
Scopo della tesi e metodiche: Lo scopo della tesi è quello di verificare il ruolo svolto dai geni ASS1, SOD1, RAN, GALNT7, CDH11, EIF4G1, ITGA4, IMP3 nel comportamento maligno di linee cellulari di MPM. Sono stati effettuati esperimenti in vitro di RNA interference (RNAi) su quattro linee cellulari di MPM e una linea immortalizzata di mesotelio. La metodica di RNAi è un processo di silenziamento genico post-trascrizionale, altamente specifico, che sfrutta piccole molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) con sequenza omologa a quella del gene da silenziare. Alterando dunque l’espressione genica è possibile osservare l’avvenuto silenziamento mediante Real Time RT-PCR e Western-Blot e come il fenotipo delle linee cellulari risponda in termini di apoptosi (Caspase 3/7 assay), migrazione (Wound Healing Assay), capacità proliferativa (SRB assay) e capacità di formare colonie (Colony Formation Assay, CFA).
Risultati: Tra i geni investigati RAN e SOD1 risultano essere i più promettenti, inducendo un aumento dell’apoptosi in tutte le linee cellulari di MPM e una diminuzione della proliferazione e della capacità di formare colonie in più linee cellulari di MPM. I primi due ruoli sembrano essere svolti anche da ITGA4.
Anche EIF4G1 sembra svolgere un ruolo di oncogene in più linee di MPM e un suo silenziamento induce un aumento dell’apoptosi e una diminuzione della capacità di formare colonie e della proliferazione cellulare. Inoltre il silenziamento del gene IMP3 ha determinato un aumento dell’attività caspasica e una diminuzione della proliferazione in una linea di MPM nel CFA assay e in due linee nell’SRB assay. ASS1 induce una diminuzione della proliferazione e della capacità di formare colonie in due linee cellulari. Infine CDH11 promuove un incremento dell’attività delle caspasi in una linea cellulare di MPM.
Conclusioni: Mentre l’inibizione di GALNT7 non ha prodotto effetti sul fenotipo, i restanti geni sembrano svolgere un ruolo nel mantenere il fenotipo maligno di cellule di MPM. L’approccio utilizzato ha condotto ad una migliore comprensione del ruolo svolto da questi geni nella carcinogenesi dell’MPM permettendo di valutare il loro eventuale utilizzo come biomarcatori o come potenziali target terapeutici.