ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-03202017-151213


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
VENTURA, ALESSANDRO
URN
etd-03202017-151213
Titolo
Ruolo del regolatore cromatinico SETD5 nello sviluppo di zebrafish: analisi dell'espressione e degli effetti della perdita di funzione sulla proliferazione e sul differenziamento neurale
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Prof. Andreazzoli, Massimiliano
Parole chiave
  • sistema nervoso centrale
  • setd5
  • istone metil-transferasi
  • epigenetica
  • sviluppo neurale
  • zebrafish
Data inizio appello
06/04/2017
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
06/04/2087
Riassunto
I disordini dello sviluppo neuronale costituiscono un serio problema medico ancora non risolto, e un drammatico peso per la società. La disabilità intellettiva (Intellectual Disability, ID) e i disordini dello spettro autistico (Autism Spectrum Disorders, ASD) sono i più comuni di tali disturbi, interessando il 3-5% della popolazione. L’ID è un disordine generale dello sviluppo neuronale caratterizzato da un’alterata capacità intellettiva ed adattativa. Molti individui affetti da ID presentano anche altre manifestazioni neurologiche, come gli ASD e l’epilessia. Gli ASD, che comprendono il classico autismo (descritto per la prima volta da Kanner nel 1943), la sindrome di Asperger, la sindrome di Rett ed altri disturbi, sono importanti disordini dello sviluppo neuronale caratterizzati dalla compromissione dell'interazione sociale, del comportamento e da notevole carenza comunicativa. I fattori genetici sono predominanti nella patogenesi degli ASD; la maggior parte dei geni mutati negli ASD regola processi coinvolti nella morfologia neuronale, nella biologia delle sinapsi e nella regolazione della sintesi e turnover delle proteine. I meccanismi epigenetici, come regolatori dinamici dell’espressione genica durante lo sviluppo e la vita adulta, sono coinvolti nei processi sopra citati, e così pure nell’ID e negli ASD. Mutazioni per perdita di funzione (Loss of Function, LoF) del gene SETD5 sono state recentemente identificate come cause genetiche relativamente frequenti sia dell’ID che degli ASD. Questo gene è altamente espresso nel cervello e si colloca nell’intervallo cromosomico critico deleto nei pazienti affetti dalla sindrome “microdelezione 3p25.3”, caratterizzata da ID, microcefalia e difetti cardiaci congeniti. Data la presenza di un dominio SET conservato, che catalizza tipicamente la metilazione degli istoni H3 e H4 sui residui di lisina, si ritiene che anche SETD5 possa essere una putativa metiltransferasi; tuttavia, la funzione enzimatica di metiltransferasi non è stata ancora dimostrata. I pazienti che possiedono mutazioni LoF in SETD5 presentano spesso brachicefalia che potrebbe riflettere delle anormalità cerebrali. Alcune delle persone affette dalla sindrome “microdelezione 3p25.3”, nella quale SETD5 è sempre deleto, sono microcefaliche, suggerendo che SETD5 svolga ruoli funzionali durante lo sviluppo cerebrale. Poiché le proteine con dominio SET costituiscono una famiglia piuttosto conservata nell’arco dell’evoluzione, abbiamo scelto di analizzare il gene ortologo di SETD5 umano nel pesce zebra (zebrafish, Danio Rerio), per studiarne gli effetti sullo sviluppo precoce del cervello. Abbiamo deciso di impiegare questo tipo di organismo perché è un modello animale vertebrato molto versatile e complementare ai modelli mammiferi, che presenta notevoli vantaggi in quanto i suoi embrioni hanno un rapido sviluppo esterno, sono trasparenti e facilmente manipolabili dal punto di vista genetico. Lo scopo della mia tesi è di indagare il ruolo di setd5 nello sviluppo neuronale di zebrafish per capire l’impatto di una sua LoF nei disordini neuronali dell’uomo. Per osservare i profili d’espressione del gene setd5 in embrioni Wild Type (WT) di zebrafish della linea AB, ho eseguito una Whole mount In Situ Hybridization (WISH) che consente di visualizzare l’espressione genica nello spazio e nel tempo su embrioni interi. Poiché allo stadio 48 hpf (hours post fertilization, ore dopo la fecondazione) gli embrioni sviluppano pigmento, la WISH a questo stadio è stata condotta su embrioni della linea Casper, i quali risultano privi di pigmentazione. Il risultato ottenuto mostra che durante le prime fasi dello sviluppo, setd5 risulta molto espresso nel neuroectoderma e, negli stadi più tardivi di 24 hpf e 48 hpf, soprattutto nella regione anteriore del Sistema Nervoso Centrale (SNC), quella telencefalica. Per studiare il ruolo di setd5 in embrioni WT della sola linea AB abbiamo indotto un knock-down di setd5 inibendo la traduzione del relativo mRNA tramite l’iniezione di oligonucleotidi antisenso di morfolino (MoSETD5) allo stadio di una sola cellula. Rispetto agli embrioni di controllo iniettati con un morfolino standard (MoSTD), negli embrioni iniettati con MoSETD5 abbiamo osservato diverse anomalie fenotipiche allo stadio 48 hpf: edema cardiaco, microcefalia, sviluppo di corpi ricurvi e una ridotta risposta motoria. Abbiamo voluto studiare il ruolo di Setd5 nella regolazione della proliferazione cellulare a livello del prosencefalo e mesencefalo mediante immunofluorescenza su criosezioni di 12 µm di embrioni a 48 hpf, utilizzando un anticorpo diretto contro gli istoni H3 fosforilati (pHH3), un noto marker della fase mitotica (M) del ciclo cellulare, e il volume del cervello mediante la sonda Hoechst, che marca il DNA delle cellule. Rispetto agli embrioni iniettati con MoSTD, gli embrioni iniettati con MoSETD5 presentano un ridotto volume del cervello, parallelamente ad un significativo incremento di cellule pHH3-positive. Abbiamo inoltre valutato il tasso di differenziamento delle cellule prosencefaliche sempre tramite immunoistochimica su sezioni di embrioni a 48 hpf, usando un anticorpo diretto contro HuC, un tipico marker di differenziamento neuronale. L’analisi quantitativa (area Huc+/area cerebrale) non mostra differenze significative tra gli embrioni iniettati con MoSTD e quelli iniettati con MoSETD5 suggerendo che setd5 non abbia un’influenza sul differenziamento neuronale.
Poiché il dato della diminuzione del volume cerebrale è in apparente disaccordo con quello del concomitante aumento delle cellule pHH3-positive nei morfanti per setd5, abbiamo valutato se l’inaspettato incremento di cellule mitotiche pHH3-positive potrebbe essere spiegato da un eventuale ritardo/arresto mitotico che, a sua volta potrebbe essere responsabile di un aumentato tasso apoptotico osservato nelle aree cerebrali in via di sviluppo dei morfanti per setd5. A tale scopo, abbiamo condotto un esperimento di marcatura cellulare con BrdU e una parallela valutazione dell’espressione del pHH3, tramite una doppia immunofluorescenza su criosezioni, utilizzando un anticorpo anti-BrdU in combinazione con l’impiego dell’anticorpo anti-pHH3. L’analisi dell’immunofluorescenza è avvenuta tramite la quantificazione del rapporto “(cellule pHH3 +, Brdu+)/totale cellule pHH3+” negli embrioni iniettati con MoSTD ed in quelli iniettati con MoSETD5. L’analisi quantitativa verrà condotta su vari intervalli temporali di 2 ore, presi in considerazione nel nostro esperimento, successivi ad un pulse iniziale di BrdU, disciolta nel mezzo di embrioni a stadio 24 hpf. Attualmente, i dati finora ottenuti sono relativi solo ad un intervallo temporale, quello di 10 ore dal pulse di BrdU.
File