• 3'UTR
• resistenza
• splicing
• microRNA
• Vemurafenib
• BRAF
• melanoma

Riassunto
Il melanoma è un tumore maligno che si origina dai melanociti ed è caratterizzato da quattro stadi di sviluppo. I primi due sono facilmente curabili attraverso asportazione chirurgica, mentre, ad oggi, non esiste un trattamento efficace per curare gli stadi più avanzati.
BRAF è una chinasi appartenente al pathway MAPK/ERK, il quale ha la funzione di regolare la proliferazione cellulare. Circa il 60% dei melanomi contiene una mutazione della proteina BRAF nella posizione 600. Tale mutazione porta a un’iperattivazione del pathway MAPK e, di conseguenza, a una crescita cellulare incontrollata.
Il Vemurafenib è un farmaco approvato nel 2011 per il trattamento del melanoma metastatico. Inibitore target-specifico, il Vemurafenib si lega al sito di legame dell’ATP sulla proteina BRAF mutata (V600E). A seguito di questo legame, BRAFV600E non è più in grado di fosforilare MEK, chinasi a valle di BRAF nel pathway MAPK, e la proliferazione cellulare viene bloccata. Nonostante sia il più efficace trai farmaci attualmente a disposizione, il limite maggiore nell’utilizzo del Vemurafenib è che, dopo circa sei mesi di trattamento, tutti i pazienti che inizialmente rispondono mostrano nuovamente segni di progressione tumorale, fenomeno definito come resistenza acquisita al Vemurafenib.
Il mio lavoro di tesi rientra nell’ambito di una linea di ricerca volta a studiare la regolazione dell’espressione di BRAF, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici da affiancare al Vemurafenib. In particolare, ho messo a punto un sistema modello che permetterà di identificare se e come BRAFV600E è regolato dai microRNA, piccole molecole di RNA a singolo filamento che agiscono come repressori post-trascrizionali legandosi al 3’UTR o all’open reading frame (ORF) di geni target. Tale sistema modello si basa sull’utilizzo di due plasmidi: il plasmide pMS2 esprime MS2 Binding Sites, strutture di RNA a forma di hairpin a valle delle quali è clonato il frammento di interesse; il plasmide pMS2-BP esprime la MS2 Binding Protein, in grado di riconoscere e legare gli MS2 Binding Sites. A seguito della co-trasfezione di questi due plasmidi, nell’ambiente cellulare si crea un complesso MS2 Binding Protein - MS2 Binding Sites/mRNA d’interesse, al quale si legano i microRNA. Estraendo l’RNA dalle cellule trasfettate ed eseguendo un pull down (immunoprecipitazione) seguito da RNA-Sequencing è quindi possibile identificare i microRNA fisicamente legati all’mRNA di interesse.
Nella prima parte della tesi, ho definito la lunghezza del 3’UTR di BRAFV600E nella linea parentale A375. Utilizzando la tecnica 3’ RACE, ho individuato due isoforme più abbondanti: una già nota e lunga circa 118nt, l'altra predetta come “variante trascrizionale X1” e lunga circa 1240nt.
Dalla letteratura è noto che uno dei meccanismi di resistenza al Vemurafenib è rappresentato dalla presenza di varianti di splicing che privano BRAF ORF del RAS binding domain, favoriscono la sua dimerizzazione e lo rendono insensibile all’azione del farmaco. Per ottenere tali varianti di splicing, nella seconda parte della tesi ho contribuito a caratterizzare 16 linee resistenti (8 cloni e 8 popolazioni) ottenute a partire da quattro linee cellulari di melanoma metastatico recanti la mutazione BRAFV600E e sensibili al Vemurafenib (A375, 501 Mel, SK-Mel-5 e SK-Mel-28). Ho confermato la refrattarietà di queste linee al farmaco attraverso saggi cellulari (ciclo cellulare, curva di crescita, colony efficiency e soft agar). Molteplici saggi molecolari (analisi di mutazioni genomiche e dell’espressione di specifici geni) mi hanno altresì permesso di identificare i meccanismi molecolari alla base di tale refrattarietà. In particolare, in tre cloni (A375-C1, -C2 e -C3) e due popolazioni resistenti (A375-P1, 501-P1) ho individuato 3 varianti di splicing diverse: Δ[2-10], Δ[3-8], Δ[3-10].
Infine, nell’ultima parte della tesi, ho proceduto con il clonaggio dei due diversi 3’UTR identificati, della ORF full length e della variante di splicing Δ[3-10] (rappresentativa delle varianti da noi individuate) nel plasmide pMS2. Tali plasmidi saranno utilizzati per eseguire il saggio del pull-down e quindi per identificare i microRNA che sono fisicamente legati ai due diversi 3’UTR e alle due ORF individuate. Si potrà quindi procedere con lo studio degli effetti che questa regolazione post-trascrizionale differenziale ha sulla sensibilità al Vemurafenib.