• Bacillus cereus
• FlhF
• SRP-GTPasi

Bacillus cereus è un bastoncello Gram positivo, sporigeno e mobile grazie alla presenza di flagelli peritrichi. Da lungo tempo noto per la sua capacità di provocare tossinfezioni alimentari, B. cereus è sempre più frequentemente riconosciuto anche come causa di gravi infezioni locali e sistemiche nell’uomo. Il potenziale patogenetico del microrganismo è dovuto alla secrezione di una grande varietà di enzimi e fattori di virulenza, che comprendono emolisine, fosfolipasi, proteasi, citotossine e complessi enterotossici. Un ruolo cardine nella patogenesi delle infezioni sostenute da B. cereus è svolto dall’emolisina BL (HBL), un’enterotossina trimerica costituita da una subunità B, necessaria per il legame ai recettori delle cellule bersaglio, e da due componenti aventi attività litica, L1 ed L2. Uno studio precedentemente effettuato nel laboratorio in cui è stato svolto il presente lavoro ha dimostrato che l’assenza della proteina FlhF in un ceppo mutante di B. cereus (ΔflhF) determina una significativa riduzione nella secrezione della componente L2 dell’HBL e l’alterazione del numero e posizione di flagelli sulla superficie cellulare.
Dal punto di vista strutturale, la proteina FlhF rientra nelle GTPasi appartenenti alla famiglia delle Signal Recognition Particles (SRP), i cui restanti membri, Ffh e FtsY, sono indispensabili per il targeting cotraduzionale alla membrana plasmatica di proteine destinate alla secrezione nell’ambiente extracellulare o all’inserzione nella membrana stessa. Nonostante FlhF sia imlicata nella regolazione dell’asseblassemblaggio flagellare, in nessuna specie batterica è mai stato dimostrato un rulo di FlhF nel veicolare proteine nascenti alla membrana plasmatica.
Il presente lavoro di tesi si è posto l’obiettivo di approfondire il ruolo funzionale di FlhF in B. cereus. In particolare, è stato valutato se FlhF fosse in grado di formare omodimeri, condizione ritenuta essenziale per l’attività della proteina, e se FlhF interagisse fisicamente con L2, potenzialmente agendo come SRP per tale tossina.
In una prima parte del lavoro di tesi, sono stati effettuati esperimenti di interazione proteina-proteina in vivo mediante la metodica del Bacterial Two Hybrid System (BACTH) per verificare se FlhF fosse in grado di omodimerizzare. Per gli esperimenti con il sistema BACTH sono stati allestiti numerosi plasmidi di espressione portanti il gene flhF fuso in frame con i frammenti T18 e T25 del gene codificante l’adenilato ciclasi. Questa attività enzimatica è stata usata come sistema reporter in un ceppo di Escherichia coli difettivo per l’adenilato ciclasi. Gli esperimenti hanno dimostrato la capacità di FlhF di omodimerizzare in vivo in B. cereus. Tramite il BACTH si è poi saggiata la capacità di omodimerizzazione di FlhF T253Q e FlhF D391A, due forme mutate di FlhF, ottenute tramite la metodica dell’Overlap Extention PCR. Tale approccio di mutagenesi sito-diretta ha consentito di modificare la sequenza del gene flhF wild type di B. cereus, in corrispondenza dei codoni codificanti gli aminoacidi singolarmente sostituiti nelle due proteine mutate. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le sostituzioni aminoacidiche introdotte compromettano la capacità della proteina di omodimerizzare, in maniera completa o parziale, rispettivamente per FlhF T253Q e FlhF D391A .
E’ stato poi valutato l’effetto della deplezione di FlhF, portata dal ceppo mutante ΔflhF, sul livello di espressione del gene codificante L2 (hblC) mediante Real-Time PCR quantitativa. I risultati ottenuti non hanno evidenziato differenze nel livello di espressione del gene hblC nel ceppo mutante ΔflhF rispetto al parentale, indicando che la riduzione della secrezione di L2 osservata nel ceppo mutante era da imputare direttamente alla mancanza di FlhF, quindi presumibilmente al mancato trasporto di L2 verso i sistemi di secrezione di membrana. Per questa ragione, sono stati effettuati esperimenti d’interazione proteina-proteina, in vivo ed in vitro, tra FlhF e L2 mediante le metodiche del BACTH e del pull-down. Per gli esperimenti di pull-down è stato allestito un plasmide portante flhF fuso in frame con una sequenza codificante una coda di istidine. La risultante proteina è stata immobilizzata su una colonna in grado di legare specificamente la coda di istidine. Sulla colonna è stato applicato un lisato di cellule di E. coli nelle quali era stata fatta esprimere una copia plasmidica del gene hblC. La presenza di entrambe le proteine nell’eluato della colonna, valutata in SDS-PAGE e immunoblot, indicava l’interazione proteica. I risultati ottenuti hanno mostrato un’interazione tra FlhF e la componente L2 dell’emolisina BL sia in vivo che in vitro.
Per identificare la regione di FlhF responsabile del legame con L2, le sequenze codificanti i domini funzionali B ed NG della proteina sono state clonate individualmente negli stessi vettori plasmidici impiegati nel sistema BACTH. Dagli esperimenti effettuati è emerso che i domini B e NG di FlhF sono indipendentemente capaci di interagire con L2 in vivo.
In ultima battuta, il sistema BATCH è stato utilizzato per osservare se le due forme mutate di FlhF (T253Q e D391A) fossero ancora in grado di legare L2. Gli esperimenti BACTH hanno evidenziato la completa incapacità delle due forme mutanti di legare L2 in vivo.
Nel complesso, i risultati ottenuti nel presente lavoro di tesi indicano che i) la proteina FlhF è in grado di formare omodimeri; ii)Le sostituzioni amionacidiche introdotte nelle proteine FlhF T253Q e FlhF D391A compromettono, in maniera totale o parziale, l’omodimerizzazione della proteina FlhF; iii) la delezione del gene flhF non altera il livello d’espressione del gene hblC, codificante la componente L2 dell’HBL ; iv) FlhF interagisce fisicamente, in vivo ed in vitro, con L2; v) entrambi i domini, B e NG, di FlhF sono coinvolti nell’interazione con L2; e vi) le sostituzioni aminoacidiche T253Q e D391A compromettono la capacità di FlhF di legare L2.
Questi risultati indicano, quindi, che FlhF è in grado di omodimerizzare in B. cereus e che tale capacità dipende dalla presenza di specifici residui aminoacidici. In questo microrganismo, inoltre, FlhF svolge un ruolo di SRP, presumibilmente mediando il targeting della componente L2 di HBL alla membrana plasmatica per la secrezione nell’ambiente extracellulare.