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Tesi etd-03192014-171211


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
ROMANI, CRISTINA
URN
etd-03192014-171211
Title
Caratterizzazione di una proteina ABC-transporter di P. x euroamericana clone I-214 sottoposto a stress da zinco: possibile ruolo nel sequestro intracellulare e nella tolleranza
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Supervisors
relatore Dott. Andreucci, Andrea
Parole chiave
  • Zinco
  • Pioppo
  • ABC-transporter
  • Tolleranza
Data inizio appello
07/04/2014;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
Lo zinco (Zn) è un microelemento essenziale per tutti gli organismi, comprese le piante. Svolge importanti funzioni nel metabolismo cellulare in quanto cofattore di enzimi e componente di proteine come i fattori di trascrizione a dominio Zn-finger. Un eccesso di questo metallo porta a sintomi da tossicità nelle piante, che, quindi, hanno evoluto meccanismi di tolleranza per affrontare lo stress derivante dall’eccesso di zinco nei suoli. Il genere Populus viene utilizzato come modello di piante arboree per la fitoestrazione di metalli pesanti dai suoli inquinati. Il ruolo dei trasportatori è fondamentale per consentire l’omeostasi dei metalli essenziali ed escludere dal citosol i quelli pesanti. Nelle piante sono state identficate diverse famiglie geniche codificanti numerosi trasportatori di membrana e tra questi ci sono anche gli ABC-transporter.
Gli ABC-transporter sono una classe di trasportatori molto ampia, in grado di svolgere svariate funzioni in tutti gli organismi. Sono pompe per il trasporto attivo, modulano l’attività di canali ionici, sono proteine canale oppure sono coinvolti in attività diverse dal trasporto, come la trasduzione del segnale. Sono in grado di trasportare un’ampia varietà di substrati come ioni, acidi inorganici, peptidi, zuccheri, polisaccaridi, lipidi e complessi formati da metalli pesanti legati da agenti chelanti come il glutatione. Prendono parte a processi biologici diversi, come la detossificazione cellulare, la crescita e lo sviluppo delle piante, il movimento degli stomi e la tolleranza ai metalli pesanti.
Il lavoro sperimentale svolto ha riguardato lo studio funzionale di un gene di P. x euroamericana clone I-214 codificante un putativo ABC-transporter da noi chiamato dr19 che, da studi preliminari, risulta differenzialmente espresso a dosi sub letali di Zn (1 mM). Per indagare il possibile coinvolgimento di questo gene nei meccanismi di tolleranza in risposta a un eccesso di Zn e, in particolare, al sequestro intracellulare di questo metallo, ne è stato eseguito il clonaggio da cDNA P. x euroamericana clone I-214 e P.alba clone Villafranca e la sua caratterizzazione. È stata effettua l’analisi dei livelli di espressione del gene dr19 tramite Real Time qPCR in foglie vecchie e giovani di P. x euroamericana clone I-214 in condizioni di controllo e in presenza di 1 mM di Zn, da cui si notano delle differenze nei livelli di espressione nelle foglie vecchie nelle condizioni di trattamento, rispetto il controllo. È stata studiata la localizzazione subcellulare tramite espressione transiente in protoplasti di A. thaliana in condizioni di controllo e in presenza di 200 µm di Zn, dove la proteina sembra localizzarsi a livello citoplasmatico e, in presenza di Zn, le cellule non manifestano sintomi di sofferenza. Gli studi di caratterizzazione sono proseguiti su P. alba clone Villafranca trattato in vitro con 500 e 1000 µm di Zn e ortovanadato (inibitore degli ABC-transporter): l’analisi dei parametri fisiologici ha evidenziato un aumento generale di biomassa e dello Zn assorbito e una diminuzione della biomassa nei trattamenti con ortovanadato. È stata effettua, infine, l’analisi dei livelli di espressione del gene dr19 tramite Real Time qPCR in foglie di P. alba clone Villafranca da cui non si notano delle differenze tra i trattamenti. L’assenza di stress nei protoplasti trattati con 200 µm di Zn indica un possibile coinvolgimento del gene dr19 nei processi di esclusione e/o omeostasi dello Zn nel pioppo. L’osservazione che nel P. alba fino a 1 mM di Zn (concentrazione in cui non si manifestano effetti di stress) l’espressione di dr19 non cambia, suggerisce il suo coninvolgimento nei processi di omeostasi alle concentrazioni di Zn utilizzate in quanto non compaiono sintomi di tossicità. Nel clone I-214, invece, trattato con 1 mM di Zn (dose subletale) il gene dr19 risulta sovra espresso, e questo sembra indicare un suo coninvolgimento nei processi di detossificazione in presenza di concentrazioni di Zn tali da indurre stress.
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