• biofisica
• correlazione
• FCS
• imsd
• spettroscopia di fluorescenza
• stics

Le proteine appartenenti alla famiglia Polycomb (PcG) rivestono un ruolo essenziale nella modulazione della trascrizione genica, ovvero sono regolatori epigenetici. Le PcG giocano un ruolo chiave durante lo sviluppo embrionale, nell’inibizione della proliferazione o senescenza cellulare e in molti tipi di disregolazione epigenetica alla base di patologie tumorali. Le proteine PcG si assemblano in due tipologie di complessi, con ruolo di repressori della trascrizione, denominati Polycomb Repressor Complex 1 e 2 (PRC1, PRC2). Secondo il modello biochimico più accreditato, PRC2 opera trimetilando la lisina 27 dell’Istone H3 (H3K27me3), mentre PRC1 opera ubiquitinando la lisina 119 dell’Istone H2A (H2AK119ub). Apparentemente, PRC1 riconosce ed agisce in prossimità dei siti H3K27me3, compattando localmente la cromatina e rendendola inaccessibile al macchinario di trascrizione. PRC1 si può classificare in due sottofamiglie generali: PRC1 canonico (cPRC1) e variante (vPRC1). Nonostante il meccanismo molecolare sia ancora poco chiaro, cPRC1 appare il principale fattore che induce la compattazione fisica della cromatina.
Diversi esperimenti in cellula hanno evidenziato un ruolo di regia molecolare dell’azione di cPRC1 da parte della proteina PcG BMI1. La presenza di BMI1 nell’attività epigenetica di PRC1 è particolarmente rilevante in diversi tumori, tra cui spicca il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). In particolare è stato dimostrato che la sovra-espressione di BMI1 guida le proprietà staminali associate all'induzione della transizione epiteliale-mesenchimale, promuovendo invasione, metastasi e prognosi infausta. Lo studio del BMI1 in forma isolata, tuttavia, non permette di ricavare la complessa rete di interazioni biochimiche che questa proteina ha nel contesto del cPRC1. Lo stesso può dirsi di un altro componente di cPRC1, la proteina CBX8. Alcuni studi mostrano come CBX8 riconosca H2AK119ub vicino geni che esprimono repressori della proliferazione (es: INK4). L’azione di CBX8 in cPRC1 è pertanto di reprimere dei repressori di proliferazione, favorendo l’insorgere di neoplasie come NSCLC. CBX8 appare cooperare strettamente con BMI1, ma per capire la modalità molecolare con cui questo avviene appare necessario svolgere uno studio in cellula che arrivi ad analizzare la dinamica di formazione del complesso cPRC1, contenente CBX8 e BMI1.
Questo lavoro di tesi rappresenta un primo passo nella comprensione dell’interazione dinamica tra CBX8 e BMI1 in cellule di NSCLC mediante microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Inizialmente, ho adottato una metodologia di immunofluorescenza per caratterizzare la correlazione stechiometrica tra CBX8 e BMI1 a livello di nucleo cellulare e di intorno locale (risoluzione di un sistema di microscopia, <250 nm). In cellule polmonari tumorali A549 e H358 (NSCLC) CBX8 e BMI1 hanno una positiva correlazione, significativa dal punto di vista statistico, sia a livello di tutto il nucleo che a livello locale, così come identificato dal coefficiente di Spearman (per il primo caso) e di Pearson (per il secondo). E’ interessante notare che la correlazione locale (detta anche colocalizzazioen funzionale) risulta più bassa in cellule polmonari non tumorali Beas-2B. Questi risultati suggeriscono un ruolo importante del complesso molecolare tra CBX8 e BMI1 nell’ambito della disregolazione epigenetica dell’NSCLC.
Successivamente, per poter indagare i fenomeni legati alla dinamica della formazione del complesso cPRC1 contenente CBX8 e/o BMI1, ho realizzato uno strumento di analisi dati, in ambiente MATLAB, che nel quadro teorico della Spatiotemporal Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) applicata all’analisi di immagini di microscopia di fluorescenza, mi permettesse di ottenere informazioni riguardo ai tempi caratteristici del moto e alle modalità diffusive. Dopo aver convalidato le funzionalità del sistema di analisi dati attraverso simulazioni ed esperimenti controllati, ho applicato questo strumento per evidenziare dinamiche diffusive intranucleari. In particolare ho compiuto misure su cellule in cui la proteina CBX8 o la proteina BMI1 sono fuse ad una proteina autofluorescente (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP). L’analisi dei dati ottenuti ha dimostrato, per la prima volta, la presenza di molteplici pools per ciascuna di queste proteine con caratteristiche dinamiche diverse, alcune delle quali compatibili con la formazione del complesso BMI1-CBX8.