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• hiv-1 maturation
• pcr
• plv
• pseudotyped lentiviral vectors
• sars-cov-2 spike
• seamless cloning
• vsv-g

I vettori lentivirali (LV) sono uno strumento fondamentale utilizzato per la veicolazione di materiale genetico all’interno delle cellule eucariotiche. I LV possono essere derivati dalla modificazione del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1), un patogeno tristemente conosciuto per la sua abilità di infettare e distruggere le cellule CD4+ del sistema immunitario, compromettendo progressivamente la risposta immunitaria dell'ospite e portando alla comparsa dell'AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), una condizione debilitante che rende l'organismo suscettibile a infezioni opportuniste e neoplasie. Per rendere sicuri i LV, il genoma di HIV-1 è stato profondamente modificato e frammentato nelle sue diverse componenti fondamentali. Le modifiche rispetto ad HIV-1 riguardano l’inattivazione della capacità replicativa, la riduzione dell’infettività e la pseudotipizzazione. In particolare, la pseudotipizzazione è un processo che consiste nella produzione di LV caratterizzati da una diversa glicoproteina di Envelope (Env); la risultante particella virale pseudotipizzata (PLV) è caratterizzata da un tropismo di trasduzione caratteristico della glicoproteina di Env utilizzata. Ad esempio, la glicoproteina più utilizzata per la produzione dei PLV è la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G). Essa conferisce a questi PLV la capacità di trasdurre un ampio spettro di tipologie cellulari diverse con elevata efficienza. Invece, il processo di maturazione del capside di HIV-1 che normalmente avviene per un taglio proteolitico da parte della proteasi virale una volta che il virus è gemmato dalla cellula ospite, è conservato anche nei PLV.
Lo scopo di questo elaborato di tesi è stato inizialmente quello di mettere a punto un protocollo efficace ed affidabile per la produzione di PLV per la veicolazione di materiale genetico all’interno di diverse linee cellulari utilizzate in laboratorio. In particolare, la messa a punto ha riguardato la produzione di PLV tipizzati con la glicoproteina Spike del virus SARS-Cov-2 o con VSV-G. La messa a punto ha riguardato la valutazione di diversi rapporti di trasfezione dei plasmidi necessari alla produzione dei PLVs di terza generazione, la valutazione di diverse linee cellulari di packaging e la valutazione dell’efficienza di trasduzione di diversi transgeni. L’efficienza di produzione, di impacchettamento e trasduzione dei PLV è stata valutata tramite tecniche di Western Blotting (WB), immunofluorescenza confocale high throughput e citofluorimetria FACS. Durante la messa a punto di questi protocolli, i risultati hanno dimostrato come la diversa Env influenzi non solo la produzione e l’efficienza di trasduzione delle particelle lentivirali, ma anche il loro grado di maturazione. In particolare, la maturazione di PLV pseudotipizzati con Spike di SARS-CoV-2 è risultata sempre superiore alla maturazione dei PLV VSV-G a prescindere dal protocollo utilizzato per la produzione. Partendo da questo, la seconda parte di questo elaborato di tesi vuole far luce sul fenomeno della maturazione dei diversi PLV per la caratterizzazione del meccanismo coinvolto. La comprensione di questo fenomeno potrebbe avere potenziali ripercussioni sulla conoscenza dell’elusivo meccanismo di maturazione dello stesso HIV-1. Prime ipotesi a riguardo suggeriscono che la grandezza e la composizione amminoacidica del frammento citoplasmatico (CT) delle diverse Env possa essere coinvolto nella maturazione dei LV. Con l’interscambio e/o la completa delezione del CT tra la Spike e VSV-G. L’ingegnerizzazione dei due plasmidi codificanti Env con lo scambio o la delezione delle loro CT è stata effettuata utilizzando il kit commerciale In-Fusion. Il diverso grado di maturazione dei PLV è stato valutato andando a vedere il diverso grado di processazione della proteina p24 tramite WB, previa precipitazione dei PLV ed estrazione proteica. In conclusione, in questo elaborato di tesi si sono utilizzati i PLV ottimizzandone un protocollo di produzione per la valutazione in ultima analisi delle differenze di maturazione dei PLV pseudotipizzati con diverse glicoproteine di Env. Questo, a sua volta, potrebbe avere ripercussioni sulla scoperta di nuovi bersagli per lo sviluppo di antivirali che ostacolino il processo di maturazione dello stesso HIV-1.