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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-03152009-202512


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
GUGLIELMI, CHIARA
URN
etd-03152009-202512
Titolo
Modificazioni epigenetiche al locus RB1 ed effetto bystander in cellule tumorali
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Prof.ssa Sbrana, Isabella
Parole chiave
  • effetto bystander
  • modificazioni epigenetiche
  • RB1
Data inizio appello
02/04/2009
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
02/04/2049
Riassunto
Riassunto:

Cellule esposte a basse dosi di radiazioni ionizzanti mostrano una maggiore capacità di sopravvivenza, se esposte ad una seconda e più intensa radiazione. Questa “risposta adattativa”, si ritiene sia correlata ad un cambiamento epigenetico del genoma che può essere trasmesso alle cellule figlie. Modificazioni epigenetiche sono implicate anche in effetti associati a dosi più alte di radiazioni, quali morte cellulare e instabilità cromosomica, che risultano rilevabili non soltanto sulle cellule direttamente colpite, ma anche su cellule non irradiate ma collocate in vicinanza delle altre; è ipotizzato che queste possano essere bersaglio da parte delle cellule colpite di segnali o mediante una comunicazione cellula-cellula o mediante il rilascio di fattori solubili. Si parla in questi casi di “effetto bystander”.
L’ipotesi che viene formulata nel lavoro di tesi, è che anche un marcatore tumorale come l’asincronismo replicativo del gene del retinoblastoma (RB1), possa essere trasmesso da una cellula tumorale ad una sana mediante, appunto, un effetto bystander. L’asincronismo replicativo è caratterizzato dalla presenza di un tempo di replicazione diverso ai loci allelici, per cui un allele è replicato prima dell’altro. Esso è tipico di loci soggetti ad imprinting; tuttavia anche geni a normale espressione biallelica, ma coinvolti nel processo tumorale come TP53 e RB1, sono risultati interessati da questo fenomeno, come osservato in alcuni studi su cellule di soggetti con tumore. Si ritiene che l’asincronismo sia associato al silenziamento di uno dei due alleli. L’idea che anche la modificazione della regolazione replicativa di questo gene possa essere influenzata da un effetto bystander nasce da un’evidenza sperimentale. Su tessuto tiroideo, infatti, è stata fatta un’analisi sul tempo di replicazione del gene Rb1 e elevati livelli di asincronismo replicativo per RB1 sono stati osservati sia nel tessuto tumorale che nel tessuto normale adiacente.
La tesi ha per obiettivo lo studio della presenza di un effetto bystander prodotto da cellule tumorali; l’asincronismo replicativo studiato è quello associato a mieloma multiplo. Per ciascun campione di mieloma, il siero separato dalla frazione cellulare è stato utilizzato per preparare un terreno condizionato che è stato poi addizionato, in concentrazioni diverse, al terreno di coltura di linfociti di sangue periferico ottenuto da donatori sani; nei linfociti coltivati è stato poi misurato il tempo di replicazione. Le cellule stesse di mieloma sono state messe in coltura e analizzate per il tempo di replicazione allo scopo di verificare la corrispondenza tra il livelli di asincronismo tumorale e quello indotto.
L’intensità dell’asincronismo per i singoli loci è stata valutata utilizzando la metodica FISH (ibridazione in situ fluorescente); essa si basa sulla distinzione di tre diversi tipi cellulare in base ai segnali dati dai singoli probes: 1) il segnale di doppia replicazione (DD), ovvero di replicazione di ambedue gli alleli, 2) di non replicazione di entrambi gli alleli (SS) e 3) di replicazione di un singolo allele (DS); è in questo ultimo caso che si parla di asincronismo. La FISH è stata realizzata con sonde a singolo locus relative a due regioni soggette a instabilità cromosomica nel mieloma multiplo: la regione 13q14.2 - 13q14.3 (probes RP11- 893E5, RP11-180A3 e RP11- 1008O15) contenente la “regione minima deleta”, frequentemente coinvolta in delezioni e caratterizzata dalla presenza del locus RB1 e di altri geni oncosoppressori, e la regione 13q34 (probes RP11-348M1 e RP11-102k13), anch’essa coinvolta in delezioni. Sono inoltre stati analizzati tramite FISH i geni PYGM e CFTR (probes RP11-902J19 e RP11-1152A23 rispettivamente), quali geni a tempo di replicazione noto e quindi loci di riferimento per i precedenti. I risultati suggeriscono che fattori presenti nel siero possono essere implicati nella variazione della replicazione in cellule target.

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