• Fluorescence Assay
• Luciferase Assay
• Mesothelin
• Mesothelioma
• MSLN
• Reporter Genes

Da diversi anni alcune ricerche si stanno concentrando sullo studio del gene MSLN, che codifica per una glicoproteina di membrana che prende il nome di “mesotelina” (MSLN), e della sua forma solubile o “soluble mesothelin releated peptide” (SMRP). MSLN risulta sovraespresso in diversi tumori fra i quali l’adenocarcinoma pancreatico, il cancro ovarico e il mesotelioma pleurico maligno (MPM). Uno degli aspetti che hanno destato interesse nello studio di MSLN è stato il possibile utilizzo dei livelli sierici di SMRP come biomarcatore diagnostico per il MPM, sebbene la sensibilita’ e la specificita’ non siano elevate. Da quanto sembra emergere da studi preliminari, lo studio di polimorfismi localizzati in regioni regolatorie del gene MSLN potrebbe contribuire ad incrementare la performance di SMRP come biomarcatore diagnostico. All’interno del promotore di MSLN è inoltre presente una sequenza di 18-bp, poco a monte del sito d’inizio trascrizione, denominata CanScript, che sembra responsabile della sua espressione cancro-specifica. Questa sequenza potrebbe essere utilizzata per la costruzione di vettori che, portando all’espressione di determinati geni esclusivamente in cellule tumorali, potrebbero trovare impiego nel trattamento di quelle forme di cancro caratterizzate da incrementati livelli di mesotelina.
Lo scopo di questo progetto è quello di approfondire le attuali conoscenze sulla regolazione dell’espressione del gene MSLN nel MPM, studiandone in dettaglio la regione del promotore con un metodo basato sull’utilizzo di proteine fluorescenti come geni reporter.
L’utilizzo di questo metodo dovrebbe portare un’elevata riproducibilità dei risultati grazie alla possibilità di trasfettare un singolo vettore (HR220PA-1) contenente sia gene reporter (copGFP) che normalizzatore (mRFPruby) e di valutare i livelli di fluorescenza senza bisogno di ricorrere a lisi cellulare, consentendo una più approfondita analisi sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo. Sono state clonate all’interno del vettore, a monte del gene codificante per la copGFP, 4 varianti del promotore di MSLN che, da precedenti esperimenti con reporter luminescenti, avevano mostrato diversi livelli di attività. Cellule di mesotelio non maligno immortalizzato (Met5A) sono state trasfettate con i costrutti ottenuti e analizzate al citofluorimentro per valutare se il sistema in esame fosse abbastanza sensibile da permettere di apprezzare le piccole variazioni che erano già state evidenziate con il saggio della luciferasi. È stato quindi approfondito il ruolo che polimorfismi localizzati in regioni regolatorie a monte del sito di inizio traduzione possano avere nell’espressione di MSLN e, contestualmente, sono state esaminate porzioni più piccole del promotore rimuovendo brevi sequenze al 3’, immediatamente a monte del sito di inizio trascrizione, allo scopo di identificare con maggior precisione la regione responsabile dell’attiva trascrizione del gene nel mesotelioma.