• effetti dell'alcool nelle abilità alla guida
• estrazione dell'RNA
• genotipizzazione

L’alcol, insieme al fumo, l’attività fisica e l’alimentazione, ha assunto un’ importanza sempre maggiore soprattutto per le conseguenze che l’uso eccessivo di bevande alcoliche può avere sui consumatori, i giovani in particolare, tanto da parlare di grave pericolo per la salute individuale e collettiva. Il consumo di alcol è fortemente influenzato dal contesto culturale, sociale, economico e politico.
Il danno causato dall'alcol, oltre che al bevitore, si estende alle famiglie e alla collettività, gravando sull'intera società: da qui l’idea di uno studio sulla Genetica dell’alcol.
Il consumo di alcol e i suoi effetti tossici sono influenzati da fattori ambientali e genetici che ne variano la farmacocinetica, da ciò consegue un’ampia variabilità interetnica e interindividuale. Il metabolismo dell’etanolo avviene principalmente a livello epatico a carico degli enzimi alcol deidrogenasi (ADH), che ossidano l’etanolo ad acetaldeide, e aldeide deidrogenasi (ALDH) che trasformano l’acetaldeide in acetato. Un terzo enzima metabolizza solo il 10% dell’etanolo in acetaldeide. Questo enzima è un’ isoforma del citocromo P450 2E1 (CYP2E1).
Sulla base delle evidenze emerse da un recente studio di espressione genica (Yukiko Kimura et al., 2009) il presente progetto di tesi ha previsto l’allestimento di uno studio di real-time RT-PCR al fine di valutare l’espressione del gene ALDH2 nei linfociti prima e dopo l'assunzione di alcol. Dodici individui volontari hanno accettato, tramite la firma di un consenso informato, di sottoporsi a prelievi di sangue in 4 tempi. Il primo prelievo è stato effettuato prima della somministrazione di alcol, i successivi tre sono stati effettuati rispettivamente dopo 1, 2 e 3 ore dall’assunzione di alcol. La quantità di vino da somministrare (0,4 g di etanolo per Kg di peso corporeo di un vino al 13 % in etanolo) è stata calcolata correggendo per il sesso e la superficie corporea.
Dal sangue ottenuto è stato estratto l’RNA che, dopo retrotrascrizione a cDNA, è stato sottoposto a RT real time PCR.
Gli stessi volontari hanno inoltre accettato di donare il proprio DNA tramite uno sciacquo buccale con una soluzione salina allo 0,9% NaCl. Tali soggetti sono stati dunque genotipizzati per il polimorfismo rs886205 (-360G/A) presente nella regione 5’-UTR del gene ALDH2 al fine di investigare la possibile correlazione tra tale variazione e differenti profili di espressione genica.
La genotipizzazione è avvenuta tramite PCR allele specifica (ASO-PCR) seguita da corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2%.
In collaborazione con il dipartimento Vie e Trasporti della Facoltà di Ingegneria dell’Università di Pisa è’ stato inoltre condotto uno studio parallelo sul VNTR 40 pb presente nella regione 3’-UTR del gene DAT1 che sembra essere coinvolto nella patogenesi dell’ Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD).
Quaranta volontari si sono sottoposti ad una simulazione di guida durante la quale la macchina perde aderenza, in modo da calcolare per ciascuno soggetto il tempo necessario per riportare il veicolo in traiettoria. Tale test è stato condotto sia in condizioni di sobrietà sia dopo aver assunto alcol.
La quantità di vino da somministrare per ciascun soggetto è calcolata in base alla sua superficie corporea, come se fosse un farmaco, utilizzando il calcolatore on-line Body Surface Area Calculator for medication doses( http://www.halls.md/body-surface-area/bsa.htm ). La genotipizzazione è avvenuta tramite PCR e elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%.
Le analisi sono tese a valutare l’effetto dell’etanolo sull’attenzione e la capacità di riflesso durante la guida nonchè l’eventuale correlazione tra il VNTR 40 pb e una differente reazione allo stimolo indotto.
Risultati:
I nostri risultati finora non seguono quelli ottenuti da Kimura et al. nel 2009 su un campione di 21 maschi giapponesi, in cui tutti i volontari hanno mostrato un aumento dei livelli dell’mRNA di ALDH2 dopo l’ingestione di etanolo indipendentemente dal genotipo per rs886205 . Al contrario i nostri dati non mostrano un significativo aumento dell’espressione diALDH2 sia nel gruppo 1, soggetti con genotipo wild type (GG), sia nel gruppo 2 soggetti eterozigoti (G/A) + omozigoti per l’allele minore (A/A). La dose di vino da somministrare è stata leggermente modificata rispetto allo studio condotto da Kimura, normalizzandola sulle differenze di genere e BSA. La dose ottenuta infatti varia da uno a due bicchieri di vino a persona, rendendola molto più vicina alla realtà, in modo che i nostri dati possano essere utili nel contesto sociale. I nostri campionamenti sono ancora troppo piccoli per poter trarre conclusioni definitive, ma aumentando il numero dei soggetti i risultati potrebbero cambiare. Lo studio verrà proseguito organizzando nuovi test e possibilmente allargato ad altri geni coinvolti nella tossicocinetica dell’etanolo.
Le nostre simulazioni di guida hanno mostrato un rallentamento significativo del tempo di reazione di fronte a un evento improvviso dopo l'assunzione di una quantità moderata di alcool nei soggetti omozigoti per l’allele 9 repeat.
I tempi di reazione sono maggiori nei soggetti omozigoti ed eterozigoti per l’allele 10 repeat. Tale compromissione può essere dovuta in parte agli effetti dell'alcol sul cervelletto.
Nel confronto generale tra i due gruppi di volontari, in stato di sobrietà e dopo l’assunzione di alcool, i tempi di reazioni nel secondo gruppo aumentano di cerca un secondo confermando la relazione tra l’assunzione di alcol e una diminuzione delle capacità alla guida. Negli studi precedenti l'associazione tra DAT1 e il danneggiamento delle funzioni cognitive era stato riportato solo in modo indiretto in quanto gene candidato per l'ADHD. I nostri studi preliminari, sembrano suggerire una forte associazione dell’allele 10 repeat con i tempi di reazione e una reazione più rapida nei soggetti omozigoti per l’allele 9 repeat. Se aumentando il campionamento il nostro risultato preliminare fosse confermato noi potremmo portare una prova diretta.