• del
• di
• di
• replicazione
• tempo
• transizione
• zone

La tesi ha come oggetto di studio la caratterizzazione genomica e funzionale di regioni instabili
presenti nel genoma umano contenenti duplicazioni segmentali, dette anche low-copy repeats (LCR). Le
LCR sono sequenze ripetute di DNA di dimensioni varianti da 10 a 400 Kb; esse si ritrovano in più copie
nel genoma sullo stesso cromosoma e/o su cromosomi diversi, con un’identità molto alta (95-99%).
Contengono tipi diversi di sequenze, tra cui geni e pseudo geni. Un aspetto rilevante è che le LCR sono
siti hot - spot per riarrangiamenti cromosomici, essendo target di duplicazioni, delezioni e
traslocazioni, spesso associate a disordini genetici congeniti.
Lo scopo della tesi è quello di studiare i meccanismi coinvolti nell’instabilità di alcune LCR di
rilevante interesse per la patologia umana, attraverso l'analisi dello stato replicativo delle regioni che
le compongono e il rilevamento di specifiche caratteristiche genomiche.
Recenti studi hanno, infatti, evidenziato che siti di instabilità genomica associati a patologie
sono spesso caratterizzati da zone di transizione del tempo di replicazione. Si ritiene che in questi loci
lo switch del tempo di replicazione sia legato ad un passaggio della cromatina da una struttura aperta,
trascrizionalmente attiva, ad una struttura chiusa, trascrizionalmente non attiva. Ciò comporterebbe
uno stallo della forca replicativa e l'aumentata probabilità di rotture del filamento di DNA e
conseguenti riarrangiamenti cromosomici.
La prima parte del lavoro è stata dedicata all'analisi genomica. Con l'uso di database genomici
(UCSC, Human Genome Segmental Duplication Database) sono state identificate le duplicazioni
segmentali presenti nelle regioni cromosomiche 2q13, 5q13, 6p21, 17q11.2, 17p11.2, Xq28 e 7q11.23
rispettivamente associate alle patologie: nefronoftisi giovanile familiare, atrofia muscolare spinale,
iperplasia adrenale congenita III, neurofibromatosi, sindrome di Smith-Magenis, daltonismo rosso
verde e sindrome di Williams-Beuren. Utilizzando un software appositamente messo a punto è stata
determinata per le regioni di interesse la flessibilità del DNA, per evidenziare l'eventuale presenza di
picchi di flessibilità, cosa che caratterizza altre regioni instabili, quali i siti fragili cromosomici. I dati
citati sono stati integrati con dati ChIP-chip pubblicati relativi alle modificazioni degli istoni ed altri
marcatori dello stato della cromatina. In base all’analisi genomica è stata individuata la regione
genomica 7q11.23, come la più idonea per effettuare l’analisi sperimentale sul tempo di replicazione.
Questa regione presenta duplicazioni segmentali con un’identità molto elevata ed è anche associata a
variazioni interessanti della flessibilità. Substrato di riarrangiamenti cromosomici, in particolare di una
delezione, è associata alla sindrome di Williams-Beuren.
Il tempo di replicazione di regioni diverse, esterne o interne alle LCR, sono stati analizzati
utilizzando con la metodica FISH (ibridazione in situ fluorescente) con sonde BAC locus-specifiche
selezione anche in relazione alla posizione di mappa rispetto ai picchi di flessibilità; La FISH è stata effettuata su preparati interfasici ottenuti da linfociti coltivati provenienti da tre soggetti diversi.
Alcune di queste colture cellulari sono state anche trattate con afidicolina, una sostanza che
interferisce con la replicazione del DNA e quindi promuove l’instabilità genomica. Si è così andati a
studiare il tempo di replicazione della regione 7q11.23 per identificare l’eventuale presenza di zone di
transizione del tempo di replicazione, di modificazioni epigenetiche come l’asincronismo replicativo, e di
suscettibilità allo stress re plicativo. I dati ottenuti dall'analisi in silico e sperimentale sono stati
interpolati per evidenziare l'esistenza di un’associazione posizionale tra gli elementi citati.