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Tesi etd-03132008-133158


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
MARTINI, DAVIDE
URN
etd-03132008-133158
Title
AZIONE NEUROPROTETTIVA ED ANTIANGIOGENICA DELLA SOMATOSTATINA NELLA RETINA:IL COINVOLGIMENTO DEL SOTTOTIPO RECETTORIALE 2 DELLA SOMATOSTATINA
Settore scientifico disciplinare
BIO/09
Corso di studi
NEUROSCIENZE DI BASE E DELLO SVILUPPO
Commissione
Relatore Prof. Bagnoli, Paola
Parole chiave
  • somatostatina
  • retina
  • recettori della somatostatina
  • neuroprotezione
  • neoangiogensi
  • ischemia
  • IGF
  • glutammato
  • caspasi
  • Ang
  • sst1
  • sst2
  • Tie
  • VEGF
Data inizio appello
18/04/2008;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
L’ischemia retinica è una delle principali cause della morte neuronale che accompagna importanti patologie retiniche, come ad esempio il glaucoma e la retinopatia diabetica. Diverse ricerche hanno suggerito che il sistema della somatostatina (SRIF), ed in particolar modo il recettore 2 della SRIF (sst2), può mediare un effetto neuroprotettivo nei confronti della morte neuronale indotta dall’ischemia. Tuttavia, non è noto se e come l’espressione del recettore sst2 possa mediare tale effetto e non sono noti i meccanismi coinvolti. Per studiare questi aspetti abbiamo prodotto, per la prima volta, un modello in vitro d’ischemia retinica nel topo che ha consentito di utilizzare oltre ad animali wild-type (WT) anche animali transgenici con alterata espressione del recettore sst2 nella retina come topi knock out per il recettore sst1 (sst1KO), i quali presentano una sovraespressione ed una sovrafunzionalità del recettore sst2, e topi privi del recettore sst2 (sst2KO). Dopo 1h d’ischemia, tramite marcatura TUNEL/DAPI abbiamo osservato che la percentuale di morte neuronale nelle retine WT ed sst2KO è risultata simile, mentre è risultata significativamente ridotta nelle retine con sovraespressione e sovrafunzionalità del recettore sst2. Tramite RT-PCR semiquantitativa abbiamo osservato che l’incremento della caspasi-3 indotto dall’ischemia nelle retine con sovraespressione e sovrafunzionalità del recettore sst2 è ridotto rispetto a quanto osservato nelle retine WT. Tramite un’analisi immunoistochimica abbiamo dimostrato che le differenti popolazioni neuronali retiniche rispondono in maniera differente all’insulto ischemico e che la persistenza di alcuni marker immunoistochimici è maggiore nelle retine sst1KO rispetto alle retine WT od sst2KO. In particolare, rispetto alle retine WT, la sopravvivenza delle cellule bipolari dei bastoncelli è risultata significativamente superiore nelle retine sst1KO mentre è risultata notevolmente ridotta nelle retine sst2KO. Consistentemente con il ruolo dell’incremento del rilascio di glutammato nella morte neuronale indotta dall’ischemia, tramite HPLC ESI-MS abbiamo osservato una riduzione dell’incremento del rilascio di glutammato indotto dall’ischemia nelle retine sst1KO. In aggiunta, il trattamento farmacologico con agonisti dei recettori della SRIF, quali l’octreotide (selettivo per il recettore sst2) e la pasireotide (in grado di legarsi ai recettori sst1, 2, 3, 5), i quali presentano il vantaggio di un’elevata stabilità rispetto al peptide nativo, ha indotto una significativa riduzione della morte neuronale in tutti gli strati retinici nei WT dopo 1h d’ischemia. Parallelamente alla riduzione della morte neuronale, il trattamento con octreotide ha indotto una riduzione del rilascio di glutammato. Il trattamento farmacologico con il peptide nativo SRIF-14 ha invece prodotto uno scarso effetto neuroprotettivo nei confronti dell’ischemia, compatibilmente con la sua rapida degradazione. Il ruolo fondamentale del recettore sst2 nell’azione neuroprotettiva è stato ulteriormente confermato dal fatto che il trattamento delle retine ischemiche WT con l’antagonista del recettore sst2, il cianamide, ha indotto un incremento della morte neuronale in tutti gli strati retinici. Inaspettatamente, nelle retine sst1KO l’attivazione farmacologica dei recettori della SRIF ha indotto un significativo incremento della morte neuronale e del rilascio di glutammato dopo 1h d’ischemia. Questo risultato apparentemente anomalo osservato nelle retine sst1KO sarebbe però potuto risultare compatibile con il fatto che il recettore sst2 (già di per se sovrafunzionale nelle retine sst1KO) avrebbe potuto subire il fenomeno della desensitizzazione/internalizzazione in seguito al trattamento con i suoi agonisti farmacologici. Per verificare tale ipotesi, abbiamo studiato il coinvolgimento di particolari proteine coinvolte nel meccanismo della desensitizzazione dei recettori accoppiati alle proteine G indotta dal ligando, quali la chinasi-1 dei recettori accoppiati alle proteine G (GRK1) e la chinasi regolatrice delle proteine G (RGS1). Tramite RT-PCR abbiamo dimostrato l’espressione delle GRK1 e della RGS1 nelle retine WT ed sst1KO. In un’altra serie di esperimenti, utilizzando la tecnica del SYBER Green, abbiamo osservato che 1h d’ischemia induce un notevole incremento del livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 nelle retine WT ed sst1KO. Il trattamento con octreotide ha indotto la riduzione del livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 nelle retine ischemiche WT mentre nelle retine ischemiche sst1KO in presenza dell’octreotide abbiamo osservato la riduzione del livello dell’mRNA della GRK1 ma nessun effetto sul livello dell’mRNA della RGS1, che si è mantenuto elevato. Ciò ha dimostrato l’esistenza di una diversa regolazione delle molecole coinvolte nei processi di desensitizzazione nelle retine WT ed sst1KO, ed ha suggerito che la mancata riduzione del livello dell’mRNA della RGS1 nelle retine ischemiche sst1KO sia coinvolta nel peggioramento del danno neuronale in presenza dell’octreotide. In particolare, il maggior livello dell’mRNA della RGS1 potrebbe significare una maggior disponibilità di molecole potenzialmente coinvolte nella desensitizzazione del recettore sst2 quando viene attivato dall’octreotide. Infine, mediante lo studio dell’immunofluorescenza del recettore sst2 abbiamo esaminato l’eventuale internalizzazione del recettore sst2 nelle retine ischemiche WT ed sst1KO. Ci siamo concentrati sulle cellule amacrine, poiche dopo 1h d’ischemia l’immunofluorescenza del recettore sst2 nelle cellule orizzontali e bipolari era pesantemente compromessa. Poiché dopo 1h d’ischemia, in presenza od in assenza di octreotide, non abbiamo osservato differenze sia nelle retine WT che sst1KO, i nostri risultati hanno suggerito che nell’incremento della morte neuronale e del rilascio di glutammato indotti dall’octreotide nelle retine sst1KO dopo 1h d’ischemia, non è coinvolta l’internalizzazione del recettore sst2, almeno nelle cellule amacrine. In conclusione, il nostro studio dimostra che un incremento dell’espressione e della funzionalità del recettore sst2 protegge contro il danno indotto dall’ischemia, e suggerisce che ciò possa essere dovuto, almeno in parte, all’inibizione del rilascio di glutammato mediato dal recettore sst2; in aggiunta, i nosti risultati suggeriscono e confermano la potenziale utilità degli analoghi stabili della SRIF in terapie farmacologiche volte a contrastare l’effetto neurodegenativo di alcune patologie retiniche, come il glaucoma e la retinopatia diabetica.<br>Oltre alla morte neuronale, l’ischemia retinica che accompagna diverse patologie come il glaucoma e la retinopatia diabetica proliferativa, ed in particolar modo la condizione d’ipossia/anossia tissutale che ne consegue, promuove un’anomala proliferazione di vasi sanguigni (neoangiogenesi) che, in aggiunta, presentano anomalie dal punto di vista morfologico e funzionale. Diversi fattori di crescita sono coinvolti nella regolazione della neoangiogenesi indotta dall’ipossia. Alcuni promuovono la neoangiogenesi. Tra questi il fattore di crescita delle cellule endoteliali vascolari (VEGF) ed i suoi recettori VEGFR-1 e VEGFR-2, il fattore di crescita insulino simile-1 (IGF-1) ed il suo recettore IGF-1R, l’angiopoietina 2 (Ang-2) ed il suo recettore Tie-2. Altri fattori, come l’angiopoietina-1 (Ang-1) ed i suoi recettori Tie-1 e Tie-2, promuovono la stabilità e la maturità dei vasi sanguigni esplicando, quindi, un’azione anti-angiogenica. Numerose ricerche hanno suggerito che il sistema somatostatinergico, attraverso il recettore sst2, può mediare un’azione antiangiogenica. Tuttavia non è noto se e come l’espressione del recettore sst2 possa mediare tale azione. Per comprendere se e come il recettore sst2 influenzi la neoangiogenesi ed i fattori ad essa associati, abbiamo utilizzato un noto modello murino in cui la neoangiogenesi retinica viene sperimentalmente indotta dall’ipossia. Abbiamo utilizzato topi WT, topi sst1KO ed sst2KO. L’angiogenesi è stata valutata perfondendo le retine con fluoresceina-destrano mentre i fattori associati all’angiogenesi sono stati studiati mediante RT-PCR e mediante immunoistochimica. In condizioni normossiche non sono state osservate differenze significative della vascolarizzazione tra WT e KO. In condizioni normossiche il livello dei fattori associati all’angiogenesi sono risultati simili nelle retine WT e KO, ad eccezione dell’mRNA di IGF-1, di Ang-2 e del suo recettore Tie-2. La neoangiogenesi retinica indotta dall’ipossia è risultata significativamente maggiore nelle retine sst2KO rispetto alle retine WT ed sst1KO che, in aggiunta, hanno mostrato un simile sviluppo della neoangiogenesi. L’ipossia non ha influenzato il livello dell’mRNA del recettore sst2 sia nelle retine WT che KO. L’ipossia nelle retine WT ha indotto un significativo incremento del livello dell’mRNA del VEGF, di VEGFR-1 e VEGFR-2, dell’IGF-1R, di Ang-2 e Tie-2. Nelle retine con sovraespressione e sovrafunzionalità del recettore sst2 l’incremento dell’mRNA del VEGF e dell’IGF-1R inodotto dall’ipossia è risultato significativamente minore mentre è incrementato il livello dell’mRNA di Tie-1. Al contrario, rispetto alle retine WT, nelle retine prive del recettore sst2 l’incremento del livello dell’mRNA del VEGF e dell’IGF-1R promosso dall’ipossia è risultato significativamente maggiore ed inoltre abbiamo osservato un incremento del livello dell’mRNA dell IGF-1 mentre è risultato ridotto il livello dell’mRNA di Ang-1, Tie-1 e Tie-2. I risultati dello studio condotto mediante immunoistochimica hanno confermato il maggior incremento del VEGF, dell’IGF-1 che viene indotto dall’ipossia in assenza del recettore sst2. In aggiunta, i risultati ottenuti mediante immunoistochimica hanno fornito ulteriori indicazioni sulla localizzazione ancora poco chiara dei fattori associati all’angiogenesi nella retina. In particolare abbiamo dimostrato la localizzazione del VEGFR-2, dell’IGF-1 e dell’IGF-1R nelle cellule di Müller. Nell’insieme, il nostro studio dimostra che l’espressione del recettore sst2 può modulare un’azione antiangiogenica e l’espressione dei fattori connessi all’angiogenesi, suggerendo un’importanza clinica degli agonisti del recettore sst2 nello sviluppo di eventuali strategie terapeutiche dirette contro la patologica proliferazione dei vasi sanguigni.<br>
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