• Placche carotidee
• immunoistochimica
• cromatografia

DEFINIZIONE DELL’ATEROSCLEROSI

L’aterosclerosi è una malattia complessa, multifattoriale ed a carattere evolutivo delle arterie elastiche e muscolari di grande e medio calibro, caratterizzata da lesioni intimali (definite comunemente placche) che possono essere inizialmente rappresentate da minute aree di ispessimento (lesioni elementari), ma la cui evoluzione può causare lesioni complicate. L’aterosclerosi è oggi ritenuta una malattia infiammatoria cronica, secondo la teoria di Ross, e biomarkers circolanti di infiammazione come la Proteina C-Reattiva sono considerati possibili indicatori dello stato della malattia aterosclerotica. Diversi fattori, sia genetici (come l’ipercolesterolemia familiare, l’omocistinuria, malattie della coagulazione) sia ambientali (dieta, fumo, ipertensione, malattie dismetaboliche, stress, abitudini di vita) hanno un importante ruolo eziopatogenetico.

CLASSIFICAZIONE MORFOLOGICA

Le lesioni aterosclerotiche sono classificate morfologicamente come: a) Lesioni intimali non progressive (Ispessimento intimale adattativo e Stria lipidica/Xantoma intimale), b) Lesioni aterosclerotiche progressive (Ispessimento intimale patologico, Ateroma/Fibroateroma, Placca fibrocalcifica).
EZIOPATOGENESI
Nell’eziopatogenesi dell’aterosclerosi, ha un ruolo importante l’interazione tra lipoproteine modificate ed ossidate, cellule infiammatorie come i monocito-macrofagi ed i linfociti T, e i normali costituenti della parete arteriosa. L’accumulo di lipidi nell’ intima delle arterie e la proliferazione di particolari cellule tra cui macrofagi, cellule muscolari lisce e fibroblasti danno inizio alla formazione della placca. L’accrescimento della placca, che avviene in genere lentamente, tende a restringere il lume del vaso, causando una stenosi nei vasi di medio calibro come le arterie carotidee. La placca può andare incontro a complicanze gravi come la rottura con esposizione di materiale (in genere ateroma) che può dare luogo ad una serie di eventi che conducono alla successiva formazione di trombo e quindi alla possibile occlusione o sub-occlusione del lume vascolare, ed anche a fenomeni tromboembolici. Manifestazioni cliniche severe della placca aterosclerotica complicata sono costituite da sindromi coronariche acute (come l’angina pectoris e l’infarto miocardico acuto), accidenti cerebrovascolari (come l’ictus) e l’ipertensione nefrovascolare.
BACKGROUND DELLO STUDIO
Lo stress ossidativo svolge un ruolo modulatorio nel processo infiammatorio, ed occupa un ruolo rilevante nell’aterogenesi rappresentato dall’ ossidazione delle lipoproteine LDL. Per questi motivi anche elementi che regolano i meccanismi ossidativi sono stati studiati e talora indicati come possibili biomarcatori di aterosclerosi. In particolare, diverse attività enzimatiche presenti in cellule vascolari (endoteliali, muscolari lisce, macrofagi, fibroblasti), sono state prese in considerazione. Un enzima connesso con tale attività ossido-riduttiva, è stato recentemente indicato come predittore di rischio cardiovascolare: la gamma-glutamiltransferasi (GGT). La γ-glutamil-transferasi (GGT) è un enzima localizzato sulla membrana plasmatica di diversi tipi cellulari e che catalizza il primo passaggio del processo di idrolisi del glutatione (GSH) attraverso la scissione del legame γ-glutammilico. La GGT è espressa nella placca aterosclerotica e potrebbe avere un ruolo patogenetico nella progressione dell’ aterosclerosi e nella genesi delle sue complicanze.
L’origine dell’attività di GGT riscontrata nelle lesioni aterosclerotiche non è ancora stata chiarita. E’ possibile che l’espressione di GGT sia aumentata nei macrofagi presenti nell’intima e che normalmente esprimono bassi livelli di attività di GGT. Alternativamente, l’attività di GGT riscontrata nelle placche aterosclerotiche potrebbe originare dalla GGT circolante.

PRESENTAZIONE DELLO STUDIO

Scopo del presente studio è la valutazione dell’espressione della GGT nelle placche aterosclerotiche carotidee umane, complicate e non, provenienti da pazienti sintomatici (per accidenti cerebrovascolari come TIA – attacchi ischmici transitori- o ictus) o asintomatici, mediante metodiche biochimiche ed istopatologiche (immunoistochimica), e la correlazione con gli aspetti morfologici delle placche.
Per tale scopo, i campioni provenienti dalle endoarteretomie carotidee a cui sono stati sottoposti i pazienti per disostruzione delle arterie carotidee da placche aterosclerotiche, sono stati in parte fissati in formalina ed inclusi in paraffina (per l’indagine immunoistochimica e lo studio morfologico e classificativo delle placche), ed in parte criopreservati (per le valutazioni biochimiche). Negli stessi pazienti, un campione di sangue periferico (in provetta da emocromo) è stato prelevato per la valutazione dei livelli di GGT.
La determinazione biochimica è stata condotta operando un confronto tra la GGT serica e quella contenuta all’interno della placca. La metodica utilizzata per la caratterizzazione della GGT è la cromatografia ad esclusione molecolare. La cromatografia è un processo di analisi che si utilizza per separare sostanze aventi elevato peso molecolare, soprattutto proteine e macromolecole. Alla base di questa separazione vi è una fase stazionaria, costituita da un supporto inerte con pori di dimensioni controllate, e una fase mobile, che consiste in un solvente organico o acquoso che eluisce i soluti attraverso la colonna e iniezione post-colonna di un substrato fluorescente per la GGT (γ-glutammil-7-amido-4-metilcumarina), un metodo che permette la quantificazione delle frazioni di GGT nel plasma.
La valutazione immunoistochimica è stata effettuata mediante metodica di immunoperossidasi indiretta utilizzando un anticorpo primario policlonale specifico anti-GGT (prodotto in rabbit), e come sistema di rivelazione il Complesso Avidina-Biotina, e la 3,3-diaminobenzidina tatraidrocloruro (DAB), che produce un’ intensa colorazione marrone resistente all’alcool, come substrato cromogeno. In particolare, l’ anticorpo secondario capace di legarsi al primario è un anti-rabbit coniugato con biotina. I vetrini colorati con DAB possono essere disidratati, montati con mezzi di montaggio e conservati a lungo. La forte affinità dell’ avidina per la biotina conferisce a questo metodo una sensibilità elevata soprattutto nei tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina.
Infine in ogni caso le placche sono state valutate per la presenza di infiltrati infiammatori (macrofagi e T-linfociti mediante reazioni immunoistochimiche utilizzando anticorpi monoclonali diretti contro gli antigeni leucocitari CD68 e CD3, rispettivamente) e classificate morfologicamente.