• leptina
• poliadenilazione
• 3'UTR
• CPEB

Il gene ob codifica per la leptina, un ormone-citochina prodotto prevalentemente dal tessuto adiposo bianco (WAT) e considerato un importante segnale di sazietà: da cui il nome della proteina che deriva dal greco “lepthos”, magro. Mutanti spontanei di topo, deficienti per questo ormone, sviluppano una obesità grave in fasi molto precoci della vita.
La leptina viene secreta in proporzione alla massa grassa totale e i suoi recettori sono stati individuati in nuclei ipotalamici implicati nella regolazione del bilancio energetico e di comportamenti associati alla nutrizione. L'innalzamento dei livelli plasmatici dell’ormone, causa l'attivazione di un pathway neuronale che determina una risposta anoressizante, mentre una loro diminuzione induce una risposta contraria.
La leptina è interessata anche in altri processi, quali: maturazione dell’apparato riproduttivo e del sistema immunitario, angiogenesi, omeostasi del tessuto osseo, processi infiammatori.
L'espressione della leptina è regolata da diverse condizioni croniche come: lo stato nutrizionale, l'eta' , il sesso e da stimoli acuti quali citochine, ipossia, beta-3agonisti, glucocorticoidi, insulina.
I processi molecolari che stanno alla base di alcune di queste regolazioni non sono stati ancora chiariti.
Non sono ad esempio noti elementi attivi in cis nella regione 5'-UTR del gene della leptina, che possano giustificare una regolazione da parte dell'insulina o dei glucocorticoidi. Gli elementi regolativi potrebbero quindi essere situati altrove, ad esempio nella lunga regione 3’ non tradotta (3’ UTR, circa 2700 basi) di quest’ormone che costituisce più dell’80% della lunghezza dell’intero messaggero.
La regione 3' UTR di alcuni trascritti è ritenuta un elemento essenziale nella modulazione della stabilita' (emivita) degli stessi e della loro accessibilita' da parte del
macchinario traduzionale; tali meccanismi sono chiaramente rilevanti nella modulazione della produzione proteica.
Nei vertebrati, meccanismi di questo tipo, sono attivi ad esempio durante lo sviluppo embrionale di Xenopus e di topo e nel contesto di alcune funzioni apprendimento dipendenti in neuroni adulti. In generale si tratta di sistemi che consentono il mantenimento di trascritti "dormienti" (non tradotti) in distretti subcellulari e la loro "attivazione traduzionale" in seguito a precisi stimoli.
La regolazione della lunghezza della regione 3'-UTR di questi trascritti attraverso un allungamento inducibile, a livello citoplasmatico, della coda di adenosine aggiunta in fase di maturazione nucleare dei trascritti, è stata messa in relazione con la loro attivazione traduzionale. Le tipologie cellulari interessate da questi meccanismi, sono accumunate da una estrema polarizzazione strutturale e molecolare. Tali sistemi di regolazione non sono mai stati descritti negli adipociti, ne’ studiati in relazione alla leptina. Tuttavia è noto, che nella 3’UTR di altre citochine sono presenti elementi consensus per il legame con proteine che regolano la stabilità e quindi l’ emivita dell’mRNA. Tali elementi sono caratterizzati da sequenze ricche in adenosine e uridine (A+U rich elements, AREs) e possono essere implicati nei processi di poliadenilazione citoplasmatica.
Scopo della mia tesi è stato quello di stabilire se la regione 3’UTR della leptina possa essere implicata nella regolazione della produzione dell’ormone, attraverso un meccanismo di poliadenilazione variabile del messaggero.
Poiché non esisteva in banca dati un clone completo del gene murino della leptina, abbiamo utilizzato la 3’ RACE per isolare la parte terminale del gene. Il sequenziamento di tale regione ha mostrato la presenza di alcune AREs , in particolare sono stati identificati : un segnale di poliadenilazione (esanucleotide altamente conservato AAUAAA) e alcuni elementi detti di poliadenilazione citoplasmatica (CPE) caratterizzati dalla sequenza consensus UAUUUUU(U) . La presenza dell'elemento CPE ha fatto ipotizzare che il 3'-UTR del trascritto della leptina potesse essere un target della proteina CPE-binding protein (CPEB), molecola precedentemente non caratterizzata negli adipociti, che gioca un ruolo chiave nei processi di regolazione della poliadenilazione citoplasmatica.
La presenza di CPEB nel tessuto adiposo bianco, mai riportata fino a qui in letteratura, è stata da noi dimostrata sia tramite RT-PCR che analisi di Western Blot.
Ci siamo quindi chiesti se il messaggero per la leptina subisse un allungamento variabile della coda di poliadenilazione e se questa potesse essere messa in relazione con la quantità di ormone prodotta. Si può evidenziare tale fenomeno con una paricolare tecnica di RT-PCR ancorata che, nel caso di una poliadenilazione variabile, dà luogo a dei prodotti di PCR visualizzabili su di un gel di agarosio come una banda principale con uno smear sovrastante. Questo è esattamente il pattern osservabile nel caso della leptina, utilizzando come materiale di partenza RNA estratto da tessuto adiposo bianco di topo.
Il confronto tra topo geneticamente obeso, che sovraesprime l’ormone, e topo magro non ha tuttavia evidenziato differenze nella lunghezza o nell’aspetto dello smear; questo può essere messo in relazione con il fatto che i modelli utilizzati sono cronici e complessi. Per questo motivo abbiamo ritenuto opportuno valutare l’ allungamento della coda del messaggero per la leptina in un sistema più semplice, costituito da colture primarie di adipociti, trattate o meno con gli induttori della sintesi di leptina: insulina e dexametasone. La valutazione dei livelli dell’ormone rilasciato dagli adipociti nel mezzo di coltura tramite un saggio E.L.I.S.A. , ci ha permesso di verificare l’effetto positivo degli induttori utilizzati. Dati preliminari indicano che, soprattutto nei campioni trattati con l’insulina, si osserva una associazione positiva tra l’allungamento della coda di poliadenilazione e l’aumento di produzione di leptina.
Con questo studio abbiamo quindi dimostrato che :
1. La regione 3’ non codificante del gene murino della leptina presenta elementi consensus per il legame con fattori che partecipano alla stabilizzazione dell’RNA maturo, in particolare si sono osservati elementi CPE.
2. Nel tessuto adiposo bianco di topo è presente almeno uno dei fattori che guidano la poliadenilazione citoplasmatica dei messaggeri, ovvero la proteina CPEB.
3. Il messaggero della leptina subisce una poliadenilazione variabile in vivo ed in vitro
4. L’insulina sembra modulare l’allungamento della coda in dipendenza della sua capacità di induzione sulla produzione di leptina