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Tesi etd-03102014-205348


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
CERAGIOLI, YURI
URN
etd-03102014-205348
Title
Espressione e purificazione di CLAN
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Commissione
relatore Prof.ssa Tozzi, Maria Grazia
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
07/04/2014;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le proteine CLAN, note anche come CARD12, IPAF o NLRC4, sono un ristretto gruppo di proteine citosoliche scoperte nei primi anni 2000 (Damiano J.S., et al., 2001). Esistono 4 varianti di splicing di CLAN generate dallo stesso locus genomico di 41,3 Kbs sul cromosoma 2. Le quattro isoforme (CLAN-A, B, C, D) si differenziano per dimensioni e profilo di espressione. Le due forme più comuni sono CLAN-A e CLAN-B. L’isoforma A è quella a più alto PM ed è costituita da tre dominii: un dominio di interazione CARD al terminale amminico, un dominio Leucine Rich Repeat (LRR) al terminale carbossilico e un voluminoso dominio NACHT in posizione centrale. CLAN-A è espressa nel tessuto polmonare, nella prostata, nel cervello, nel fegato e nei leucociti ad eccezione dei linfociti. L’isoforma B si differenzia dalla prima per l’assenza del dominio NACHT ed è espressa a vari livelli in tutti i tessuti. Dal punto di vista funzionale CLAN fa parte dell’infiammosoma un complesso proteico che media l’attivazione della Caspasi 1, con la quale CLAN interagisce direttamente. La Caspasi 1 attivata media a sua volta il rilasco di Il-18, Il-1β e l’attivazione della Caspasi 7 giocando così un ruolo nei processi infiammatori e di morte cellulare. Molto però deve essere ancora scoperto su CLAN, in particolare sull’isoforma B, i cui dati in letteratura scarseggiano. Recentemente uno studio esplorativo di doppio ibrido in lievito condotto da Tozzi e collaboratori (2013, dati in fase di pubblicazione) ha individuato una sequenza riconducibile a CLAN-A e CLAN-B come possibile partner di interazioni con la 5’nucleotidasi citosolica II (cN-II). La cN-II è un enzima citosolico appartenente alla superfamiglia HAD, estremamente conservato nell’evoluzione, ubiquitariamente espresso, in grado di catalizzare sia l’idrolisi di GMP e IMP sia il trasferimento del gruppo fosfato da un nucleotide donatore a un nucleoside accettore come la guanosina o l’inosina. Gioca un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare dove regola i livelli intracellulari di IMP e GMP, oltre a partecipare ad altri pathways metabolici come il ciclo delle ossipurine. La sua importanza è confermata dal fatto che il suo silenziamento in cellule di astrocitoma induce apoptosi. La cN-II inoltre è in grado di agire su analoghi purinici usati come profarmaci antivirali e antitumorali ed è coinvolta nella sindrome di Lesch-Nyan. Tutto questo ha posto la cN-II al centro dell’attenzione di diversi gruppi di ricerca e oggi si sa molto sulla sua struttura proteica e su quella del sito attivo, sulla regolazione e sul meccanismo di catalisi, mentre poco è stata fatto per esplorare le possibili interazioni che l’enzima può avere con altre proteine e componenti cellulari. Tenendo conto di queste premesse scopo di questa tesi è stata l’espressione eterologa di CLAN e la sua purificazione, con la duplice finalità di migliorare tanto le conoscenze su CLAN che quelle sulle interazioni della cN-II. Per farlo, cellule di Escherichia Coli ceppo Rosetta sono state trasformate con un plasmide codificante per CLAN-B, a sua volta ottenuto per modifica di un plasmide codificante per CLAN-A. Nei batteri è stata indotta l’espressione della proteina di interesse; sono state poi testati diversi protocolli di purificazione, operanti sia in condizioni denaturanti che in condizioni native, per individuare quello più adatto alla purificazione di CLAN-B. Per completezza sono stati condotti studi anche sull’espressione eterologa di CLAN-A.
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