• Hirudo medicinalis
• PACAP-38
• plasticità sinaptica

PACAP-38 è un peptide di 38 amminoacidi la cui sequenza è ben conservata in molte specie animali. Le sue funzioni sono molteplici e sembra avere un ruolo cruciale nell’instaurarsi dell’apprendimento e della memoria sia nei Vertebrati che negli Invertebrati. Per i suoi effetti neurotrofici e neuroprotettivi ha suscitato interesse come agente terapeutico in patologie neurodegenerative caratterizzate da deficits cognitivi. In questo lavoro, abbiamo analizzato l’azione di PACAP-38 su meccanismi cellulari che sottostanno a forme di apprendimento non associativo nel modello di Hirudo medicinalis.
Sebbene preliminari analisi biomolecolari non abbiano evidenziato, nel sistema nervoso (SN) della sanguisuga, sequenze geniche che avessero alta omologia con quella codificante per il peptide e/o per i suoi recettori in altri sistemi biologici, PACAP-38 è un peptide fortemente conservato lungo la scala filogenetica. Inoltre, H. medicinalis è un modello adatto per indagare sui meccanismi che sottostanno all’instaurarsi di forme di apprendimento, in quanto permette di correlare cambiamenti del comportamento con modificazioni dell’attività cellulare e dei circuiti neurali.
L’analisi è stata condotta sia a livello comportamentale che a livello cellulare e di circuito.
In animali aventi il ganglio cefalico disconnesso dal primo segmentale sono stati indotti cicli di nuoto applicando sulla cute, in posizione caudale, lievi stimoli elettrici (stimolo test) costituiti da treni di impulsi quadri (5 msec) della durata complessiva di 1,6 sec alla frequenza di 8,3 Hz. Mediante un opportuno software collegato ad un dispositivo ON/OFF, è stato misurato l’intervallo di tempo che intercorre tra l’applicazione dello stimolo test e l'inizio del nuoto (latenza), prima e dopo iniezione di una soluzione contenente PACAP-38 a varie concentrazioni (0,01 nM - 1 nM).
La valutazione delle variazioni di latenza indotte dall’iniezione di PACAP-38 ha dimostrato che, alla concentrazione di 0,1 nM, il neuropeptide produce effetto sensitizzante.
Lo stimolo test da noi utilizzato attiva selettivamente le cellule sensoriali T. La riduzione della latenza riscontrata in seguito all’applicazione di PACAP-38 indica una maggiore responsività dell’animale allo stimolo test, suggerendo che PACAP-38 possa modulare l’attività elettrica dei neuroni T.
Sono state quindi condotte registrazioni intracellulari da neuroni T appartenenti a gangli segmentali estratti da animali naïves e perfusi per 5 minuti con PACAP-38 5·10-3 nM. Sono stati valutati i seguenti parametri elettrofisiologici: voltaggio a riposo (Vm), resistenza di ingresso (Rm) misurata su impulsi iperpolarizzanti (0,5 nA) di 200 msec, e ampiezza dell’iperpolarizzazione postuma (AHP) che caratterizza il firing di queste cellule. I nostri dati hanno evidenziato che PACAP-38 determina una riduzione significativa dell'ampiezza della AHP che si osserva a 10 e a 20 minuti di lavaggio senza indurre cambiamenti di Vm e Rm.
In passato, studiando la connessione sinaptica tra due neuroni T è risultato che la modulazione dell’ampiezza della AHP nell’elemento presinaptico, determina variazioni dell’efficacia sinaptica. In particolare, ad una riduzione dell’ampiezza della AHP nella cellula presinaptica, corrisponde un incremento nell’ampiezza del potenziale sinaptico (PS) nella cellula postsinaptica.
L’effetto PACAP-indotto di riduzione dell’ampiezza della AHP nelle cellule T suggerisce che, in analogia con quanto osservato in precedenza, il peptide possa produrre una maggiore capacità delle cellule T di veicolare lo stimolo tattile producendo una risposta natatoria più repentina.
Registrazioni intracellulari sono state condotte contemporaneamente dal soma di due neuroni T appartenenti allo stesso lato di gangli segmentali di sanguisughe naïves, e sono stati analizzati gli effetti di PACAP-38 sulla connessione sinaptica tra i due neuroni misurando l’ampiezza dei PSs nell’elemento postsinaptico dopo induzione della AHP nell’elemento presinaptico. È risultato che PACAP-38 alla concentrazione di 5·10-3 nM determina una riduzione dell’ampiezza della AHP, che non produce l’atteso aumento dell’ampiezza dei PSs. Sono state condotte registrazioni allo scopo di valutare l’effetto del neuropeptide sulla connessione sinaptica, indipendentemente dall’induzione di una AHP a livello presinaptico: si è osservato che PACAP-38 di per sé riduce la forza sinaptica tra due cellule T in quanto determina una riduzione dell’ampiezza dei PSs evocati da uno stimolo test. Questi dati indicano che, quando la concentrazione del neuropeptide è tale da indurre nelle cellule T una riduzione dell’ampiezza della AHP di entità tale da ottenere un incremento dell’ampiezza dei PSs che contrasti e superi l’effetto inibitorio diretto del PACAP sulla connessione sinaptica, si può avere facilitazione sinaptica che si manifesta a livello comportamentale in una repentina risposta allo stimolo tattile.
Il fatto che gli effetti di PACAP-38 si manifestino dopo 10 minuti dall’applicazione suggerisce che il neuropeptide attivi una cascata di trasduzione del segnale intracellulare. Allo scopo di comprendere i meccanismi intracellulari attivati da PACAP-38, sono stati condotti esperimenti per valutare la via dei secondi messaggeri attivata dal neuropeptide: l’utilizzo di LY 83583 0,1 mM, un bloccante delle guanilato ciclasi, ha dimostrato che non è coinvolta la via del guanosin monofosfato ciclico; mentre esperimenti in cui è stato utilizzato il bloccante dell’adenilato ciclasi MDL12330A 1mM hanno messo in evidenza il coinvolgimento della via dell’adenosin monofosfato ciclico (cAMP).
È stato inoltre indagato un possibile coinvolgimento sia delle protein chinasi cAMP-dipendenti (PKA) che delle protein chinasi attivate dai mitogeni (MAPK). In letteratura, infatti, numerosi studi hanno dimostrato che questi due fattori intracellulari rappresentano i target molecolari che cAMP può attivare nella cascata intracellulare attivata da PACAP.
Registrazioni intracellulari condotte in presenza dell’inibitore delle PKA Rp-8Br-cAMPS 20mM, hanno dimostrato che l’azione indotta dal PACAP è PKA-indipendente; al contrario, l’effetto del peptide è abolito dall’inibizione delle MAPK con PD98059 10mM. PACAP-38 riduce l’ampiezza della AHP attivando, via cAMP, le MAPK e non le PKA.
Nei neuroni T la AHP è determinata principalmente da un incremento dell’attività della pompa Na+ /K+-ATPasi e solo parzialmente dall’attivazione di una conduttanza K+/Ca2+-dipendente apamina-sensibile.
In presenza apamina 1 nM (inibitore della conduttanza) PACAP-38 5·10-3 nM si è dimostrato in grado di ridurre l’ampiezza della AHP, indicando che l’azione del neuropeptide coinvolge una modulazione dell’attività della pompa Na+ /K+-ATPasi.
Dai nostri risultati emerge che PACAP-38, attivando la via di cAMP/MAPK, riduce l’attività della pompa Na+ /K+-ATPasi che determina una riduzione dell’ampiezza della AHP. Tale azione modifica l’integrazione sensoriale operata dai neuroni T, producendo un effetto sensitizzante in risposta alle lievi stimolazioni tattili che inducono il nuoto nella sanguisuga.