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Il Parkinson è una malattia neurodegenerativa ad evoluzione lenta, ma progressiva, che compromette funzioni coinvolte nel controllo del movimento e dell’equilibrio, sfociando in sintomi quali bradicinesia, rigidità muscolare e tremore a riposo.
Evidenti caratteristiche neuropatologiche della malattia sono la perdita dei neuroni dopaminergici nella sostantia nigra e la presenza di inclusioni intracellulari di α-syn, chiamati Lewy bodies.
È stato osservato che mutazioni o polimorfismi del gene SNCA, codificante per α-syn, sono responsabili, rispettivamente, di forme autosomiche dominanti e forme sporadiche di Parkinson.
α-syn è una proteina di 14 kDa, trovata fisiologicamente nel terminale presinaptico dei neuroni, che sembra essere coinvolta nella plasticità sinaptica.
Indispensabile per il processo di aggregazione è un motivo altamente idrofobico che comprende 65-90 residui amminoacidici, presente nella regione centrale della proteina.
αsyn, infatti, esiste in modo predominante in forma monomerica, ma ciò non esclude la possibilità di formare multimeri stabili e/o di adottare differenti strutture sotto specifiche condizioni di stress-inducibile o mediante interazione con altre proteine, specifici ligandi, lipidi e membrane biologiche.
Nel processo di aggregazione i monomeri di a-syn formano inizialmente oligomeri o protofibrille con una forma sferica, di dimensioni variabili, ma ancora solubili; successivamente, α-syn subisce un drastico cambiamento strutturale, assumendo una conformazione a β-foglietto che si assembla in fibrille o aggregati all’interno delle cellule.
Tali aggregati sono presenti sia nel citoplasma che sulla superficie del reticolo endoplasmatico.
Lo scopo di questa tesi è stata la creazione di un biosensore in grado di rilevare e di seguire nel tempo l’aggregazione in cellule vive, tramite in vivo-cell imaging.
Per lo sviluppo di tale biosensore ci siamo serviti della metodologia FRET che rivela la presenza di un segnale soltanto quando le due molecole fluorescenti, dette donatore ed accettore, sono ad una opportuna distanza.
I biosensori per l’espressione citoplasmatica sono stati ottenuti clonando separatamente CFP e YFP, due varianti di GFP, in frame con il C-terminale di αS WT (pcDNA-αS), mentre per l’espressione nel reticolo i biosensori sono stati generati clonando separatamente CFP e YFP in frame con il C-terminale di αS nel plasmide pCMV-ER-αS, che dirige l’espressione di αS nel reticolo endoplasmatico, attraverso una sequenza di localizzazione e ritenzione.
Una volta ottenuti i vari cloni, stabilità, livello di espressione e localizzazione subcellulare sono stati controllati tramite l'espressione transiente in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y.
Attraverso Western Blot ho verificato che il peso molecolare fosse quello corretto e che le proteine fossero nella porzione solubile, mentre, per mezzo della microscopia confocale, ho potuto osservare la localizzazione cellulare mediante immunofluorescenza con un marcatore per il reticolo.
A questo punto, ho testato se i biosensori fossero in grado di riconoscere aggregati di αS nelle cellule, sfruttando il segnale FRET.
Ho seminato le cellule SH-SY5Y su vetrini wilkoa il giorno prima e poi trasfettate con αS-CFP e αS-YFP, sia la variante citoplasmatica che del reticolo, singolarmente o in combinazione.
Dopo la trasfezione le cellule sono state differenziate con acido retinoico per 24h e quindi rilevata la presenza di aggregati di αS mediante la comparsa di un segnale FRET monitorato in vivo utilizzando il microscopio confocale.
Solo l’espressione dei due plasmidi insieme, C-αS-CFP e C-αS-YFP o la variante ER, produce un segnale FRET.
Il passo successivo sarà quello di mettere a punto un modello cellulare stabile ed inducibile per monitorare il processo di aggregazione di αS come avviene nelle cellule viventi.