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Tesi etd-02272015-180143


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
CIVIDINI, FEDERICO
URN
etd-02272015-180143
Title
Structural and functional studies of cytosolic 5’-nucleotidase II (cN-II)
Settore scientifico disciplinare
BIO/10
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE E MOLECOLARI
Commissione
relatore Prof. Jordheim, Lars Petter
controrelatore Dott. Chaloin, Laurent
controrelatore Prof.ssa Camici, Marcella
tutor Prof.ssa Tozzi, Maria Grazia
Parole chiave
  • cytosolic 5’-nucleotidase II
  • cN-II
  • functional studies
Data inizio appello
03/03/2015;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
03/03/2018
Riassunto analitico
La 5’-nucleotidasi citosolica II (cN-II) è una proteina enzimatica citosolica dalla doppia natura catalitica che fosfoidrolizza i nucleosidi monofosfati purinici con particolare affinità per IMP e GMP. cN-II contribuisce a ripristinarne i livelli catalizzando la formazione di un nuovo nucleoside monofosfato in presenza di un nucleoside accettore a cui viene trasferita la molecola di fosfato che durante la catalisi di fosfoidrolizzazione rimane legata alla forma intermedia dell’ enzima. Per queste ed altre sue proprietà, discusse in abbondanza nel mio lavoro di tesi, nel corso degli anni, cN-II ha attirato l’attenzione della comunità scientifica che ha affrontato lo studio della stessa da numerosi punti di vista quali la biochimica, la cristallografia, la biologia molecolare, l’oncologia, la farmacologia e la genetica. Ad oggi si ha una discreta conoscenza delle proprietà catalitiche, della distribuzione tissutale e dell’abbondanza relativa, nonchè dei principali ruoli fisiologici che caratterizzano cN-II. L’enzima, infatti, appare espresso in maniera ubiquitaria sempre a basse concentrazioni, ad eccezione di quei tessuti altamente rigenerativi e di cellule maligne. Ne è stato accertato, anche, il ruolo chiave nel mantenere l’omeostasi di IMP, precursore di tutti i nucleotidi purinici. Inoltre numerose evidenze si sono accumulate in merito al probabile ruolo cruciale che l’enzima riveste nell’ interferire con l’attivazione di numerosi farmaci usati per contrastare la proliferazione di cellule tumorali laddove è emersa o un’espressione maggiore sia della proteina che del suo prodotto di trascrizione o forme mutate dell’enzima che lo rendono iperattivo. Tale mole di informazioni, sebbene eterogenea e ancora di difficile lettura certa, ha indotto la comunità scientifica a proporre di considerare cN-II come un potenziale target farmacologico. Per questo, numerosi sforzi si stanno compiendo per meglio definire, a lato di ciò che si sa già, il/i ruolo/i fisiologici mediati dalla cN-II, cosi da poter meglio capire per quali motivi tale proteina risulti essere enigmatica nell’ insorgenza di fenomeni di resistenza alle comuni terapie antitumorali che si avvalgono prevalentemente di analoghi nucleosidici come antimetaboliti in grado di bloccare la proliferazione cellulare maligna. In questo contesto si inserisce il mio lavoro di tesi dottorale che nell’arco dei tre anni in cui si è svolto mi ha visto lavorare a cavallo tra due gruppi di ricerca: il gruppo della Pr.ssa Maria Grazia Tozzi presso l’unità di Biochimica del dipartimento di biologia dell’ Università di Pisa e il gruppo del Pr. Charles Dumontet, sotto la supervisone del Dr. Lars Petter Jordheim, presso il Cancer Research Centre di Lione. Nella tesi che segue ho cercato dunque di meglio definire l’impatto che l’ enzima ha sul metabolismo dei nucleotidi intracellulari avvalendomi di modelli cellulari in cui l’espressione di cN-II potesse essere sia stabilmente che inducibilmente alterata. Ho utilizzato poi questi modelli per investigare gli effetti di tali alterazioni e ho cercato di porli al centro del problema dell’ insorgenza dei fenomeni di resistenza farmacologica sopra menzionati. Parallelamente ho affrontato studi in vitro di carattere biochimico con l’intento di definire la relazione tra analoghi di adenosina di prima e seconda generazione e cN-II. Inoltre ho ampliato il mio punto di vista investigativo cercando possibili interattori proteici cellulari che potessero indicare nuove vie di studio verso la conoscenza del complesso scenario in cui la cN-II si inserisce. Quello che è emerso dai miei studi è che l’ espressione di cN-II risulta critica per il mantenimento dell’omeostasi non del solo di IMP ma di molti altri nucleosidi e soprattutto nucleotidi intracellulari. Inoltre simili risposte in diversi modelli hanno confermato un ruolo chiave sia dell’ espressione che dell’ attività dell’ enzima nella proliferazione cellulare e hanno evidenziato non solo le già note correlazioni con fenomeni di resistenza all’ effetto di nucleosidi analoghi ma altresì hanno evidenziato interferenze con altre categorie antimetaboliche farmaceutiche. In aggiunta, tra gli analoghi di adenosina, è stato identificato un ruolo inibitore e interattore della fludarabina rispetto a cN-II che ha fornito delucidazioni sul meccanismo di azione citotossica del farmaco, prima non noto, e che ha posto le basi per considerare di testare la fludarabina, in quanto inibitore di un potenziale target farmacologico, in associazione ad altri farmaci in terapie farmacologiche sinergiche. Per quanto riguarda l’ indagine di possibili interattori di cN-II, è stata accertata un’ evidente e fisiologica relazione di interazione tra cN-II e Ipaf, proteina che riveste un ruolo chiave nei meccanismi immunitari innati. Tale interazione ha posto le basi per lo studio, d’ora in avanti, di cN-II come proteina regolativa di importanti fenomeni cellulari, quali l’ infiammazione e conseguente apoptosi mediata dai recettori del sistema immunitario innato. In conclusione, i risultati del lavoro mio e dei miei colleghi sono stati in parte pubblicati su riviste internazionali: S. Allegrini, D.N. Filoni, A. Galli, A. Collavoli, R. Pesi, M.G. Tozzi (2013) Expression of Bovine Cytosolic 5′-Nucleotidase (cN-II) in Yeast: Nucleotide Pools Disturbance and Its Consequences on Growth and Homologous Recombination. Plos One. 8: e63914. doi: 10.1371/journal.pone.0063914; F. Cividini, R. Pesi, L. Chaloin, S. Allegrini, M. Camici, C. Dumontet, L.P. Jordheim and M.G. Tozzi (2015) The purine analogue fludarabine acts as a cytosolic 5’-nucleotidase II inhibitor. Biochemical Pharmacology. doi:10.1016/j.bcp.2015.01.010; F. Cividini, S. M.G. Tozzi, A. Galli, R. Pesi, M. Camici, C .Dumontet, L.P. Jordheim and S. Allegrini (2015) Cytolosolic 5’-nucleotidase II interacts with the leucin rich repeats of NLR family member Ipaf. Plos One. doi: 10.1371/journal.pone.0121525; ed in parte proposti ma non ancora accettati: F. Cividini, C. Machon, R. Pesi, S. Allegrini, M. Camici, C. Dumontet, L.P. Jordheim and M.G. Tozzi. Stable modulation of cytosolic 5’-nucleotidase II in human glioblastoma ADF cells is associated with modified cell proliferation rate and sensitivity to anticancer agents. Submitted; F. Cividini, D.N. Filoni, R. Pesi, S. Allegrini, M. Camici, M.G. Tozzi. IMP-GMP specific 5’-nucleotidase regulates energy charge and prodrug metabolism. Submitted.
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