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La biosintesi dei carotenoidi è ormai ben definita. La prima fase del processo biosintetico, mediata dalla fitoene sintetasi (PSY), prevede la condensazione di due molecole di geranilgeranil difosfato a produrre fitoene. Nelle piante superiori il fitoene subisce quattro reazioni di desaturazione, mediate dalla fitoene desaturasi (PDS) e dalla β-carotene desaturasi (ZDS) che conducono alla produzione di licopene.
Lo scopo della presente tesi è l’isolamento in girasole della regione codificante la PSY (HaPSY) e lo studio, mediante RT-PCR semiquantitativa, dell’espressione dei geni codificanti la ZDS (HaZDS) e la PSY in relazione all’organo, lo stadio di sviluppo, l’intensità luminosa ed il contenuto in pigmenti fotosintetici.
Mediante tecniche di RT-PCR e 3’-5’RACE è stata isolata la sequenza codificante (cDNA) del gene HaPSY. La sequenza (1598 bp) è costituita dalla porzione codificante (CDS) di 1242 bp, da 172-nucleotidi della regione 5’ non tradotta (5’-UTR), e da 170-nucleotidi della regione 3’-UTR.
Il livello di trascrizione dei geni HaPSY e HaZDS risulta molto elevato nei cotiledoni, nelle foglie giovani e nelle foglie mature; al contrario, la loro trascrizione si riduce sensibilmente nel fusto e soprattutto nelle radici.
Il fattore ambientale che più di ogni altro condiziona la carotenogenesi nel cloroplasto è la luce. I dati ottenuti in girasole indicano che il passaggio buio-luce (conversione dell’ezioplasto in cloroplasto) e l’incremento della intensità luminosa determinano il concomitante accumulo di carotenoidi e di trascritti di ambedue i geni.
Allo scopo di valutare se in girasole esiste una correlazione tra il contenuto in pigmenti ed il livello di trascrizione di HaPSY e HaZDS sono stati utilizzati due mutanti monogenici caratterizzati da un diversa composizione e/o contenuto totale in carotenoidi: non dormant-1 (nd-1) e xantha1 (xan1). xan1 è molto suscettibile ai processi di foto-ossidazione e presenta, anche a modeste intensità luminose, una riduzione della clorofilla a, un notevole accumulo di zeaxantina ed un considerevole abbattimento del contenuto in β-carotene. Il mutante nd-1 è caratterizzato da una delezione al locus del gene che codifica per la ZDS che determina il blocco genetico della biosintesi dei prodotti finali e un sensibile accumulo di prodotti intermedi (cis-fitoene, fitofluene e β-carotene). Nei cotiledoni del mutante xan1 il contenuto in carotenoidi decresce progressivamente passando da 3 a 600 µmol m-2 s-1. A fronte della diminuzione di pigmenti tuttavia, il livello di trascrizione dei geni HaPSY e HaZDS aumenta di circa due-tre volte, analogamente a quanto osservato in piante di controllo.
Alla più bassa intensità luminosa (1 µmol m-2 s-1) non emergono differenze significative fra il controllo ed il mutante nd-1 nell’espressione del gene HaPSY. Questo dato indica che la completa assenza di β-carotene e xantofille non promuove un aumento di trascrizione del gene HaPSY. Quando invece le condizioni di intensità luminosa determinano un accumulo preponderante di cis-fitoene, la quantità di trascrizione del gene che codifica per la fitoene sintetasi viene significativamente inibita. Una analoga inibizione dell’espressione del gene HaPSY si osserva utilizzando l’erbicida fluridone che in piante di controllo determina un accumulo di cis-fitoene. Tali risultati suggeriscono che un meccanismo di regolazione a “feedback” negativo, si può attivare anche quando si verifica un accumulo di un precursore dei carotenoidi finali. Tuttavia in presenza di elevate quantità di cis-fitoene l’inibizione del livello di espressione è circoscritto al gene che codifica per l’enzima della carotenogenesi che agisce nella biosintesi subito a monte poiché nelle plantule trattate non sono stati osservati cambiamenti significativi nel livello di trascrizione del gene HaZDS. Un comportamento analogo si verifica nel mutante nd-1 alla intensità luminosa di 1 µmol m-2 s-1 quando l’accumulo di β-carotene non altera il livello di trascrizione del gene HaPSY.