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SARS-CoV-2 è un virus a RNA a singolo filamento a polarità positiva appartenente alla famiglia Coronaviridae e al genere dei Betacoronavirus. È stato isolato in Cina nel gennaio 2020 e a marzo dello stesso anno l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha dichiarato pandemica la malattia COVID-19, causata dal virus stesso.
SARS-CoV-2 entra nelle cellule bersaglio mediante l’interazione tra il receptor binding domain (RBD) della glicoproteina Spike (S) e il recettore umano Enzima convertitore dell’angiotensina 2 (ACE2). Nel corso dell’infezione, le due branche dell’immunità specifica, umorale e cellulare, si attivano per l’eliminazione del virus. A causa delle difese immunitarie carenti, i pazienti immunocompromessi che contraggono l’infezione da SARS-CoV-2 sono a più alto rischio di malattia grave e di mortalità da COVID-19. Inoltre, questi soggetti presentano anche una maggiore probabilità di sviluppare un’infezione persistente, cioè di risultare positivi al tampone molecolare per SARS-CoV-2 per più di 21 giorni dal primo test positivo. Risulta, quindi, importante indagare alcuni aspetti della risposta immunitaria di questi pazienti fragili al fine di determinare le migliori strategie per la loro gestione.
Lo scopo di questo lavoro è quello di valutare la risposta immunitaria specifica in un gruppo di pazienti immunocompromessi con infezione da SARS-CoV-2 persistente e in un gruppo di soggetti di controllo sani.
Un primo obiettivo è stato la valutazione della risposta anticorpale protettiva contro SARS-CoV-2 con il test di neutralizzazione. Trattandosi di un virus classificato come agente patogeno con un livello di biosicurezza 3 (BSL-3), non è possibile utilizzare SARS-CoV-2 infettivo per i saggi di neutralizzazione nel nostro laboratorio. Per ovviare a questo problema e valutare la risposta anticorpale neutralizzante dei pazienti, sono stati utilizzati i vettori lentivirali pseudotipizzati (PLV), cioè vettori virali che possiedono le proteine strutturali di un Lentivirus e la glicoproteina S di SARS-CoV-2. In questo modo, il PLV avrà il tropismo cellulare di SARS-CoV-2 e si legherà alla proteina ACE2. Innanzitutto, è stato ottimizzato un protocollo per l’utilizzo dei vettori pseudotipizzati con la proteina S di SARS-CoV-2 (PLV-S). A tal fine, sono state ottenute cellule HEK-293T trasfettate stabilmente con un plasmide codificante per il recettore ACE2. I plasmi dei soggetti sono stati quindi utilizzati per determinare il titolo di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2, utilizzando il test di neutralizzazione sui PLV.
Un secondo obiettivo è stato quello di indagare la presenza di un’eventuale correlazione tra il titolo degli anticorpi neutralizzanti e la risposta immunitaria mediata dai linfociti T. Nello specifico, per valutare la risposta cellulo-mediata di questi pazienti, è stato condotto il saggio ELISpot, una tecnica che consente di valutare la proporzione di linfociti T produttori di interferone gamma, misurando il rilascio di questa citochina in seguito alla stimolazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) con peptidi di SARS-CoV-2 (derivanti dalle proteine S e Nucleocapsidica) e con la Pp65 del citomegalovirus come controllo.
Infine, per verificare un’eventuale correlazione fra la persistenza dell’infezione da SARS-CoV-2 e l’immunità contro altri Coronavirus che infettano l’uomo, un altro obiettivo di questo lavoro è stato la valutazione dell’immunità anticorpale nei confronti di HCoV-229E, un Alphacoronavirus conosciuto da tempo come causa del comune raffreddore. Per far questo, sono stati eseguiti degli esperimenti di Western Blot separando le proteine virali di HCoV-229E mediante corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide ed incubandole con i plasmi dei soggetti in studio, utilizzando questi ultimi al posto dell’anticorpo primario.
I risultati ottenuti hanno consentito di determinare il titolo di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 nel gruppo di soggetti in esame, ponendolo in relazione con i dati derivanti dal saggio ELISpot e con la risposta anticorpale nei confronti di HCoV-229E.