• glicosilazione
• Streptococcus Pneumonae 14

Lo Streptococcco Pneumoniae 14 (SP 14) è responsabile di un gruppo vastissimo di patologie che possono portare a complicazioni come: batteriemia, meningite, polmonite, otite media, sinusite e bronchite. Ad oggi, l’unica cura è la terapia antibiotica che però ha causato negli anni farmaco-resistenza rendendo sempre più inutile tale terapia e portando alla formazione di ceppi resistenti. Per questo motivo L’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO), indica la vaccinazione come unica soluzione realmente efficace contro le malattie pneumococciche ed inserisce nel gruppo “ very high priority ” lo sviluppo di nuovi vaccini contro queste. Lo Streptococco Pneumoniae 14 (SP 14) presenta nella sua capsula un’ unità tetrasaccaridica ripetuta del tipo : {6) - [ β-D- Galp – (β- (1-4)-] β-D—Glc pNAc- (β- (1-3)-β- D- Galp- (β-(1-4)- β- D- Glcp- (1-}n. È stato provato che l’unità tetrasaccaridica coniugata con proteine immunogeniche, induce la formazione di anticorpi specifici contro Pn14PS; quindi l’obiettivo finale di questa Tesi, è rappresentato, proprio dalla sintesi dei tetrasaccaridi, che recano in posizione anomerica o un metile o uno spaziatore portante un gruppo amminico protetto, che permetta, in seguito, la coniuganzione con una proteina immunogenica. La sintesi prevede 3 step principali :
a) preparazione dei glicosidi 4-OH-β-D-glucosamminici, ortogonalmente protetti al C-3 e al C-6 portanti in posizione anomerica un metile o un braccio spaziatore propiltosilico o propilammidico, mediante apertura nucleofila dell’α-ossazolidina intermedia, facilmente ottenibile a partire dal cloroidrato della D-glucosammina commerciale.
b) la β-galattosidazione degli accettori β-D-glucosamminici a dare, dopo deprotezione selettiva al C-6, i derivati 6-OH-β-D-lattosamminici.
c) la β-lattosidazione al C-6 degli accettori disaccaridici a dare i desiderati tetrasaccaridi.
a)α-peracetil-D-glucosammina, ottenuta trattando con Ac2O-Py, la D-glucosammina cloridrato (commerciale), viene trasformata nella corrispondente α-ossazolidina attraverso l’uso di un promotore acido come il TMSOTf (1.14 eq) in DCE anidro a 50°C, la purificazione flash cromatografica su gel di silice permette di isolare il prodotto puro e in resa del 95%. In seguito, l’intermedio è stato sottoposto ad un attacco nucleofilo da parte degli alcoli MeOH, N-t-butossicarbonil-amminopropanolo e 3-O-tosil-1,3-propandiolo per ottenere i β-glicosidi corrispondenti, successivamente trasformato nell’azide corrispondente, attraverso una reazione SN2, in presenza di NaN3 e TBAI in DMF. Le reazioni sono state condotte in ambiente rigorosamente anidro (presenza di setacci molecolari) e in atmosfera inerte (Argon), usando promotori acidi, facendo riferimento a metodiche riportate in letteratura.La labilità alle condizioni acide della funzione t-butossicarbonilica ci ha indotti a proseguire la sequenza sintetica usando solo i derivati con il gruppo Me e azidico per ottenere i desiderati accettori lattosamminici.Il prosieguo della sintesi ha previsto la desacetilazione operata con MeONa in soluzione metanolica, ma operando alla temperatura di 0°C per evitare l’idrolisi del gruppo acetammidico; dopo 1.5 ore si formano, come unici prodotti, i corrispondenti trioli che vengono isolati per semplice neutralizzazione della miscela di reazione con resina acida seguita da filtrazione ed evaporazione del solvente. Successivamente, era necessario proteggere le posizioni 3 e 6 con gruppi ortogonali, in particolar modo per C3, con un gruppo permanente, mentre per C6, con un gruppo temporaneo; a tal scopo bisognava distinguere le posizioni 3 e 4 aventi simile reattività; per ovviare a tale problema si è ricorsi alla formazione di un acetale ciclico di tipo isopropilindenico sui carboni C4 e C6, mediante l’uso di 2-metossipropene e CSA in DCM, la purificazione flash cromatografica permette di isolare i derivati corrispondenti puri in resa rispettivamente del 85% e dell’ 88% calcolata a partire rispettivamente dall’alcol corrispondente.Successivamente la posizione 3 di viene protetta con gruppi di diversa natura (eteri come i benzili ed esteri come acetili e benzoili) per valutare l’influenza sulla reattività della posizione 4. La benzilazione è stata effettuata usando BnBr, KOH e etere-corona; mentre la benzoilazione è stata effettuata con BzCl in piridina e l’acetilazione con Ac2O e piridina. La purificazione flash cromatografica fornisce i prodotti desiderati puri e in ottime rese; la posizione 3 del metil glicoside invece, viene protetta con un benzoile, seguendo le stessa metodica usata per ottenere il precedente glicoside con il braccio azidico. Considerato che tutti i passaggi della sequenza sintetica avvengono con rese molto elevate e portano alla formazione di un unico prodotto è possibile effettuare le successive reazioni sui prodotti grezzi in modo da limitare le purificazioni cromatografiche. A tal scopo la trasformazione del triolo (metil glicoside) nel derivato benzoilato in 3 è stata condotta efficacemente (resa su tre passaggi 58%), applicando la sequenza sintetica illustrata precedentemente per l’analogo con il braccio propilazidico, senza effettuare purificazioni cromatografiche intermedie. Successivamente si opera l’idrolisi del ponte isopropilindenico con CH3COOH acquoso al 70 %, per ottenere i corrispondenti dioli.A questo punto viene protetta la posizione 6 con gruppi ingombranti, in un primo momento con una funzione di tipo etereo (p-metossibenzile, PMB) attraverso l’iniziale formazione di un intermedio non isolabile di tipo stannilidenico, seguita da una apertura dell’acetale con un agente alchilante elettrofilo come il PMBCl; successivamente, in virtù della sua maggiore resistenza agli acidi, si utilizza il TBDMS. La reazione è condotta in piridina usando TBDMSCl e dopo purificazione flash cromatografica si ottengono i derivati sililati in ottime rese.
Passaggio chiave, è a questo punto, la reazione di β-galattosidazione, previa sintesi dei donatori galattosidici attivati in posizione anomerica (OTCA, SPh, Br). È stato effettuato uno studio sistematico al fine di trovare le condizioni di glicosilazione migliori per ottenere l’accettore lattosamminico in buone rese. In tutte le reazioni di glicosidazione, l’anidricità dell’ambiente è garantita, sia dalla presenza di setacci molecolari attivati, che dalla rimozione di tracce di acqua dall’accettore e dal donatore mediante formazione di un azeotropo con toluene ed evaporando la soluzione alla pompa meccanica munita di una trappola raffreddata a -78°C. Le numerose prove di glicosilazione, evidenziano che se la reazione viene interrotta dopo poche ore, vengono isolati numerosi sottoprodotti come il disaccaride β-1,2-gal-gal, i rispettivi ortoesteri e i corrispondenti accettori acetilati in 4. La formazione di questi sottoprodotti è stata razionalizzata ammettendo che, gli ortoesteri sono gli intermedi nella reazione di glicosilazione e bloccando la reazione dopo poche non si ottiene la loro completa conversione nei glicosidi voluti; la formazione di β-1,2-gal-gal, che complica la purificazione del disaccaride desiderato a causa della similare mobilità su silice, è spiegabile ammettendo l’idrolisi del donatore tricloroacetimmidato, che subisce, poi uno shift di acile dal C2 al C1, per subire poi, nell’ambiente di reazione una β-galattosidazione in posizione 2. Analizzando tutti i risultati ottenuti nelle β-galattosidazioni degli accettori prima sintetizzati, utilizzando come promotore il TMSOTf e come donatore il tricloacetimmidato, è stato evidenziato che le condizioni ottimali per ottenere i derivati disaccaridici voluti sono: a) 1.5 equivalenti di donatore tricloacetimmidato; b) presenza di setacci molecolari AW-300 attivati. c) 0.5 equivalenti di TMSOTf aggiunto a -30°C; c) evoluzione della reazione a temperatura ambiente; e) tempi lunghi di reazione; in queste condizioni è possibile isolare, dopo purificazione flash cromatografica quasi esclusivamente i disaccaridi in rese superiori al 50%. Successivamente è stata idrolizzata la protezione in 6 (CH3COOH acq. 70%), al fine di ottenere l’accettore lattosamminico (in tutti i casi la resa supera il 90%). L’ultimo passaggio della nostra sequenza sintetica per ottenere le unità tetrasaccaridiche prevede una β-glicosidazione fra gli accettori 6-OH-lattosamminici e il tricloroacetimmidato lattosidico. Questa glicosilazione presenta minori difficoltà rispetto alla precedente β-galattosidazione, ciò è spiegabile dal coinvolgimento di un gruppo alcolico primario e dall’assenza di gruppi acido-labili, che consente l’uso di quantità superiori di promotore. Le condizioni utilizzate prevedono un eccesso (1.4 eq.) di glicosil donatore sottoposto a glicosidazione con gli accettori sintetizzati (2 eq.) impiegando BF3Et2O (1.2 eq.) come promotore e CH2Cl2 anidro come solvente.
Tutti i composti sintetizzati, non riportati in letteratura, sono stati completamente caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico e i dati NMR, ricavati utilizzando tecniche monodimenzionali (1H e 13C) e bidimensionali (DEPT-135, COSY, HETCOR) sono in accordo con le strutture proposte.