• blocco farmacologico del RAS
• Fattore Tissutale (TF)
• Sistema renina-angiotensina (RAS)

RIASSUNTO

Il sistema renina-angiotensina aldosterone (RAAS) svolge un ruolo fisiopatologico fondamentale nell’ipertensione, che a sua volta rappresenta uno dei principali fattori di rischio per le patologie cardiovascolari. L’ipertensione arteriosa, la sintesi di Fattore Tissutale (TF) e il pathway dell’Angiotensina (Ang) II sono strettamente legati da interazioni multiple. Il TF, una proteina integrale di membrana, è l’iniziatore della via estrinseca della cascata coagulativa. Studi recenti evidenziano la presenza del TF in diverse condizioni patologiche: nelle lesioni presenti in pazienti con infarto del miocardio è riscontrato un incremento dell’attività del TF; pazienti coronarici acuti presentano livelli più elevati sia di TF legato ai monociti, sia di TF circolante rispetto a pazienti con angina stabile e a soggetti normali, suggerendo una potenziale liberazione del TF a livello dell’arteria coronarica durante l’ischemia acuta. Agenti pro-infiammatori come il TNF-α e l’endotossina batterica (LPS) sono in grado di stimolare l’espressione del TF sulla membrana di monociti/macrofagi. Nel corso degli ultimi anni diversi studi hanno correlato la sintesi e la conseguente espressione del TF all’AngII, effettore principale del RAAS. Oltre al RAAS sistemico, un sistema peptidergico attivato nel momento in cui si verificano condizioni di ipotensione e di caduta della pressione media di perfusione renale, è stata ormai accertata la presenza di un RAS espresso localmente da vari tessuti, in cui l’AngII attraverso il legame al recettore AT1 determina l’attivazione del fattore nucleare di trascrizione NF-κB che promuove l’infiammazione vascolare e la sintesi del TF. Farmaci che interferiscono con le reazioni enzimatiche del sistema RAS potrebbero diminuire l’espressione e la sintesi del TF, modulando il suo effetto procoagulante. Un’attivazione persistente del RAS è causa di ipertensione e di danno d’organo a livello cardiovascolare, renale e cerebrale per cui farmaci che interferiscono con tale sistema potrebbero avere un importanti risvolti in ambito clinico.
Lo scopo della tesi è stato quello di valutare l’effetto di alcuni farmaci su questo sistema, in particolare sull’attivita procoagulante del TF e sulla sua espressione antigenica in cellule mononucleate umane isolate da sangue periferico di donatori sani. I monociti sono stati isolati usando un gradiente di densità discontinuo Ficoll/Hystopaque, incubati con LPS (0.1 μg/mL) e concentrazioni crescenti (10-11M-10-6M) di Aliskiren, Zofenopril e Olmesartan per 18 ore a 37 °C. L’attività procoagulante del TF (PCA) è stata misurata tramite il test della coagulazione (one-stage clotting assay) a seguito di tre cicli di congelamento e scongelamento per rompere la membrana plasmatica delle cellule e liberare il TF, registrando il tempo necessario affinché si formasse il coagulo nel bagno termostato alla temperatura di 37 °C. Successivamente sugli stessi campioni i livelli di TF antigene (Ag) sono stati misurati tramite un saggio immunoenzimatico ELISA usando un Kit commerciale specifico per il TF.
Il nostro principale oggetto di studio è stato Aliskiren che fa parte della più recente classe di farmaci che interferisce con il sistema RAS, recentemente approvata per il trattamento dell’ipertensione, ovvero gli inibitori diretti della renina (DRIs).
Aliskiren modula l’attività procoagulante del TF e la sua espressione antigenica in cellule mononucleate stimolate con LPS, con una curva dose-risposta anomala, in quanto a concentrazioni maggiori del farmaco non corrisponde una maggiore inibizione. La concentrazione di Aliskiren statisticamente significativa a cui corrisponde una più efficace inibizione della renina è risultata essere 10-9 M in analogia a quanto già riportato in letteratura. Successivamente per avvalorare il nostro modello sperimentale abbiamo voluto valutare anche l’effetto degli inibitori dell’enzima di conversione dell’Ang II (ACEIs), e degli antagonisti del recettore AT1 dell’Ang II (ARBs) già noti in letteratura. Zofenopril, l’ACEI da noi usato, modula l’attività procoagulante del TF e la sua espressione antigenica in maniera dose-dipendente, per cui a concentrazioni maggiori corrisponde una maggiore inibizione, di cui 10-6 M è risultata essere la dose di inibizione maggiormente significativa. Invece per quanto riguarda gli ARBs abbiamo utilizzato come modello l’effetto di Olmesartan e osservato che in maniera similare allo Zofenopril modula l’attività procoagulante del TF e la sua espressione antigenica e anche in questo caso 10-6 M è risultata essere la dose di inibizione maggiormente significativa. Alla fine del lavoro abbiamo valutato se la somministrazione combinata dei tre farmaci Aliskiren, Zofenopril e Olmesartan, alle rispettive dosi di inibizione più efficaci 10-9 M, 10-6 M, 10-6 M, potesse aggiungere ulteriore efficacia rispetto alla loro singola somministrazione. In questo caso si osserva una modulazione dell’attività procoagulante del TF e della sua espressione antigenica ma non si riscontra nessun significativo effetto additivo di inibizione. Questi risultati sono in accordo con l’idea che il blocco farmacologico a ciascun livello del sistema RAS possa essere completo e che per tale ragione la somministrazione di un altro farmaco non aggiunge ulteriore efficacia farmacologica.
Nel loro complesso i risultati ottenuti in questo lavoro, potrebbero suggerire che un’interferenza con il sistema RAS può ridurre il rischio di complicanze cardiovascolari tipiche di alcune patologie come l’ipertensione, e può contribuire a spiegare l’effetto di riduzione di complicanze trombotiche osservato nei pazienti ipertesi trattati con questi farmaci.